М.В. Медведева, Н.Б. Гусев - Определение концентрации белка в растворе (1123317), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Закон Бугера-Ламберта-Бера и границы его применения.2. Спектр поглощения белков. Спектрофотометрическое определениеконцентрации белка по поглощению раствора в ультрафиолетовойобласти спектра. Влияние светорассеяния и возможных примесейнуклеиновых кислот или нуклеотидов на поглощение белка врастворе. Коэффициенты молярного и весового поглощения.Определение молярной (М) и весовой (мг/мл) концентрации белка.Определение концентрации смеси белков в растворе.
Достоинства инедостатки спектрофотометрического метода.3. Колориметрические методы определения концентрации белка.Калибровочные графики. Белки-стандарты, предъявляемые к нимтребования и определение их точной концентрации. Принципы ичувствительность различных колориметрических методов, ихдостоинства и недостатки.3.1. Биуретовый метод.3.2. Микробиуретовый метод.3.3. Метод Лоури.3.4.
Определение концентрации белка с бицинхониновой кислотой.3.5. Метод Бредфорд.4. Флуоресцентные методы определения концентрации белка.4.1. Определение концентрации белка с флуорескамином: принципметода, его чувствительность, достоинства и недостатки.38Практическая работаЦель: Определение концентрации белка в растворе различными методами исравнение полученных результатов.План работы:1. Спектрофотометрическоеопределениеконцентрациибелкастандарта и белка X (с неизвестной концентрацией).2. Построение калибровочных графиков с использованием белкастандарта и определение неизвестной концентрации белка Xмикробиуретовым методом и методом Бредфорд.3.
Сравнение результатов, полученных разными методами.Реактивы:!. Стандартный раствор БСА с концентрацией ~1 мг/мл (для построениякалибровочного графика).2. Раствор белка X с неизвестной концентрацией.3. Биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедикта).4. NaOH - 6%-ный водный раствор.5. Рабочий раствор Кумасси G-250.6. Этиловый спирт - 50%-ный раствор (для мытья кювет).1. Спектрофотометрическое определение концентрации белка-стандартаи белка X (с неизвестной концентрацией).Точную концентрацию стандартного раствора БСА определяютспектрофотометрически и рассчитывают по формуле Бугера-Ламберта-Бера.Коэффициент удельного поглощения при 280 нм считают равным 0,646мл/см*мг (см. выше).1.
Возьмите две кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см (1=1см). В одну из них внесите 3 мл воды (контрольная проба), оботритестенки кюветы фильтровальной бумагой, поместите в кюветноеотделение спектрофотометра и обнулите показания прибора. Длинаволны - 280 нм.2. В другую кювету внесите 3 мл стандартного раствора БСА сконцентрацией~1мг/мл, такжеоботрите стенкикюветыфильтровальнойбумагой,поместитев кюветное отделениеспектрофотометра и определите значение оптического поглощениябелкового раствора.3.
По формуле Бугера-Ламберта-Бера определите концентрациюстандартного раствора БСА.4. Сравните полученной значение с предполагаемым (~1 мг/мл).395. Проделайте те же самые операции с раствором белка X. Коэффициентудельного поглощения при 280 нм считайте также равным 0,646мл/см*мг.6. Проверьте полученную концентрацию белка X у преподавателя.2. Определение концентрации белка X микробиуретовым методом.1.
Заполните таблицу 1, рассчитав, с учетом чувствительности данногометода, для каждой пробы стандартного ряда необходимое количествобелка-стандарта (БСА) (в мг и мл) и объем воды. Общий объембелкового раствора должен составлять 2 мл.2. ПосколькуконцентрациюбелкаXвыужеопределилиспектрофотометрически,с учетом чувствительности методарассчитайте количества и соответствующие объемы этого белка иводы, которые нужно внести в параллельные пробы, чтобы припоследующем измерении их оптическое поглощение попало в пределыкалибровочного графика.
Вы можете внести одинаковое количествобелка во все 3 параллельные пробы, либо разное его количество (какуказано в таблице 1). Общий объем образца (белок+вода) долженсоставлять 2 мл.3. Возьмите 9 стеклянных пробирок и пронумеруйте их.4. В пробирки №№ 0-5 (пробы стандартного ряда) внесите раствор белкастандарта и воду, согласно таблице 1.5. В пробирки №№ 6-8 внесите белок X и воду, согласно таблице 1.6. Перемешайте пробы.7. Поочередно добавьте во все 9 проб по 2 мл 6%-ного раствора NaOH и0,2 мл реактива Бенедикта.8. Перемешайте пробы и инкубируйте их при комнатной температуре 15минут.9. Определите оптическое поглощение проб при длине волны 330 нм ивнесите данные измерений в таблицу 1.
В качестве контроляиспользуйте пробу № 0, не содержащую белка (контрольная кювета).Сначала измерьте оптическое поглощение проб калибровочного ряда,затем тщательно промойте рабочую кювету и измерьте оптическоепоглощение проб, содержащих белок X.10.По данным измерений постройте калибровочный график (см. рис. 3) иопределите содержание белка X в пробах №6-8.11. Рассчитайте исходную концентрацию белка X (в мг/мл) для каждойпараллельной пробы и найдите среднюю величину.12.
СравнитеконцентрациибелкаX,определенныеспектрофотометрически и микробиуретовым методом.3. Определение концентрации белка X методом Бредфорд.1. Заполните таблицу 2, рассчитав, с учетом чувствительности данногометода, для каждой пробы стандартного ряда необходимое количествобелка-стандарта (БСА) (в мг и мл) и объем воды. Общий объем40белкового раствора должен составлять 100 мкл. Подумайте, удобно лииспользовать для построения калибровочного графика раствор БСА сконцентрацией 1 мг/мл.2.
С учетом чувствительности метода рассчитайте количества исоответствующие объемы белка X и воды, которые нужно внести впараллельные пробы, чтобы при последующем измерении ихоптическое поглощение попало на калибровочный график. Вы можетевнести одинаковое количество белка во все 3 параллельные пробы,либо разное его количество. Общий объем образца (белок+вода)должен составлять 100 мкл.3. Возьмите 9 пробирок Эппендорф на 1,5 мл и пронумеруйте их.4. В пробирки №№ 0-5 (пробы стандартного ряда) внесите раствор белкастандарта и воду, согласно таблице 2.5.
В пробирки №№ 6-8 внесите белок X и воду, согласно таблице 2.6. Поочередно добавьте во все 9 проб по 1 мл рабочего раствора КумассиG-250.7. Тщательно перемешайте пробы (на Vortex) и проинкубируйте их прикомнатной температуре 2-5 минут.8. Определите оптическое поглощение проб при длине волны 595 нм ивнесите данные измерений в таблицу 2. В качестве контроляиспользуйте пробу № 0, не содержащую белка (контрольная кювета).Сначала измерьте оптическое поглощение проб калибровочного ряда,затем тщательно промойте рабочую кювету 50%-ным спиртом (водаполностью не отмывает краситель со стенок кюветы) и измерьтепробы, содержащие белок X.9.
По данным измерений постройте калибровочный график (см. рис. 3) иопределите содержание белка X в пробах №6-8.10.Рассчитайте исходную концентрацию белка X (в мг/мл) для каждойпараллельной пробы и найдите среднюю величину.11.СравнитеконцентрациибелкаX,определенныеспектрофотометрически, микробиуретовым методом и методомБредфорд.12.Сравните полученные результаты с данными преподавателя ирассчитайте ошибку определения каждого метода.41Таблица 1. Схема заполнения проб и величины их оптическогопоглощения при определении концентрации белка микробиуретовымметодом.Стандартныйраствор белка(??? мг/мл)н2о(мл)NaOH(мл)РеактивБенедикта(мл)2220,20,20,2D).=330мм№стмгмл--д д012р320,2,420,2520,2АРНЯАтныйБЕЛО20мг белка(пографику)1-0,420,2К2-0,620,2X3-0,820,2Ч увстви тельность метода: 0,1-2,0 м г белка в пробеУ словия: инкубация 15 м инут при комнатной тем пературе>.
= 330 нм1 = 1 смбелок-стандарт - БС А ~1,0 м г/мл42мг/млмг/мл(сред.)I ill) ища 2. Схема заполнения проб и величины их оптического поглощенияи/щ определении концентрации белка методом Бредфорд.Стандартныйраствор белка(??? мг/мл)н2о(мкл)РастворКумасси(мл)DХ=595нм№(’1Л 1» 0II я 1Д Д 2А31»Т4IIМй5мкгМкл--1001101111мг белка(пографику)ькЛокX123111Ч увстви тельность метода: 1-10 м к г белка в пробеУсловия: инкубация 2-5 м инут при ком натной тем пературеА. = 595 нмI = 1 смбелок-стандарт - БСА ? мг/мл43мг/млмг/мл(сред.)О Ф О Р М Л Е Н И Е ЗАДАЧИЗадача оформляется в соответствии со следующим планом:1) Название работы.2) Краткоетеоретическоевведение(ненадопереписыватьметодическое пособие, но основные принципы используемых Вамиметодов надо описать).3) Цель работы.4) Ход работы.4.1.
Реактивы.4.2. Подробное описание последовательности Ваших действий. (Непишите сплошным текстом, выделяйте главное, фиксируйтеотклонения от методики, если они есть).5) Результаты и их обсуждение.6.1. Представьте данные по спектрофотометрическому определениюконцентрации белка-стандарта и белка X.6.2. Заполните таблицы 1 и 2, приведите калибровочные графики дляобоих колориметрических методов определения концентрациибелка.6.3. Рассчитайте концентрацию исходного раствора белка X в мг/мл иошибку определения, полученную в результате использованиякаждого из трех методов.6.4. Сравните полученные результаты.6.5. Обсудите достоинства и недостатки каждого из трех методов.7. Выводы.Выводы должны в очень сжатой форме отражать полученные Вамирезультаты.Авторы глубоко благодарны О.В. Букач, М.В.
Ким, Н.Н. Киреевой,М.В. Судницыной, О.А. Акимовой за ценные замечания, высказанные приподготовке этого методического пособия, а также за участие в подготовке ипроведении занятий в рамках раздела практикума «Современные методыбиохимии».44.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
