Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 146
Текст из файла (страница 146)
Помимо клонирования ДНК, метод ПЦР также эффективен в судебной медицине (доп. 9-1). Кроме того, 1ГЦР можно использовать для выявления вирусных инфекций прежде, чем они вызовут симптомы, а также для перенатальной диагностики генетических заболеваний. Метод ПЦР также важен для выполнения задач секвенирования целого генома. Например, картирование экспрессируемых участков на определенной хромосоме часто включает амплификапию Е5Т методом ПЦР после чего следует гибрилизация амплифицируемой ДНК с клонами упорядоченной библиотеки. Исследователи нашли также много других применений ПЦР для проекта «Геном человека», о котором сейчас и пойдет речь.
| Повторение шаговО(и(2) О1 Нагрев для разлеления нитей. 02 1'ибридизация прад меров, содержащих яскомплементарные участки с сайтами разрезания знконуклеззой рестрикции. (5')СААТТС СТТААС(5') еа 3'~=:.кдг= (5')СААТТС С ПААП(5') | Повторение шагов от О(до(3). $ ПЦР 3' | зцдопуклеззз Его к! Область ДН К, которую нужно амплифицироввть 01 Нагрев для разделения нитей. (2) Добавление синтетических олигонуклсотидных прзймеров охлаждение. О3 Добаиление термостойкой ДНК-полимерззы для катализа 5' — ь Э ' синтеза Д НК.
Синтпз ДНК (шзг(3)) кзтзлизи руется термостойкой ДН К-ио- лимсрззой (все еще присутству ющей). 1 После 25 циклов исходная последовательность амплифицировзлзсь около 15е рзз. а 9.2 Пт генов к геноиаи (453) Риш 946. Амплификацил сегмшпв ДНК полимеразной вмпиой реакцией. а) Процедура ПЦР состоит иэ трех шагов. Нити ДНК Оз разделяются при нагревании, затем ® гибридизуетсл в избытке коротких синтетических ДНК-праймеров (синие), которые ограничивают амплифицируемую область; ® полимеризацией синтезируется новая ДНК.
Эти три шага повторяют от 25 до 30 раз. Термостойкая ДНК-полимераза Тас)1 (из Тйеппиз айиабаи, бактериального вида, обитающего в термальных источниках) не денатурируется на этапах гьзгревания. б) ДНК, амплифицируемую с помощью ПЦР, можно клонировать. Праймеры могут содержазь в себе некомплементарные концы, соответствующие сайтам разрезания зндонуклеазой рестрикции. Хотя эти части праймеров и не связываются с ДНК в ходе ПЦР они включаются в амплифицируемую ДНК. Разрезание амплифицированных фрагментов в этих месшх создает «липкие концы», используемые при вшиаании амплифицированной ДНК в клонирующий вектор. й) Полимераэиая цепная реакция счтмо с Б'юъчс О~ юк(у) Клонирование при ншивании в клонируюший вектор по сзйту ЕсоРЛ 92 От генов к геиомам [455[ и у каждого есть несколько таких отличий.
Некоторые изменения в последовательности происходят на участках распознавания рестриктззами. Это приводит к различиям в раамерах фрагментов ДНК, образующихся при разрезании соответствующей эндонуклеазой рестрикции. Такие отличия называются полиморфиэмами длины фрагментов рестрикции (КН.Р, от агьцк геппсггопЯщтепг )елйгй ро ллпогрйилм). Еще один тип последовательности, часто используемый для идентификации ДНК, — это короткие тандемные повторы (хлоп ганг)ет щгеарь 5ТК). Обнаружение КН.Р основывается на специальном методе гибридизации под названием сауэернблаттинг (от англ.
зоигйегл Ыогггпд' ,рис. 1). Фрагменты, полученные при разрезании геномной ДНК зпдонуклеазами рестрикции, разделяют по размераги электрофорезом, денатурируют добавлением щелочи в агарозный гель, а затем переносят на нейлоновую мембрану для воспроизведения распределения фрагментов в геле.
Мембрану погружают в раствор с радиоактивно меченным ДНК-зондом. Зонд для после- допатсльпости, которая неоднократно повторяется в геномс человека, обычно распознает несколько из тысяч фрагментов ДНК, образующихся при разрезании генома зндонуклсазой рестрикции. Авторадиография отображает фрагменты, с которылги гибридизустся зонд, так же как и на рис.
1. Этот метод очень точный; оп начал использоваться в судебной экспертизе в конце 1980-х гг. Однако для проведения анализа требуется много недеградированной ДНК (>25 нг). Такое количество ДНК часто невозможно обнаружить на месте преступления или катастрофы. В более чувствительных методах идентификации ДНК используются возможнгкти полимеразной цепной реакции (ПЦР; см. рис. 9-16), а также анализ 5ТК.
Короткий тандемный повтор — это короткая последовательность ДНК, повторяющаяся несколько раз в определенных участках хромосомы; чаще всего последовательность содержит четыре пары нуклеотидов. Наиболее полезные лля идентификации участки ДН К обычно содержат от 4 ло 50 повторов (всего от 16 ло 200 пар нуклсотидов в случае тетрануклеотидных Локуе Хромосома Павтар Длина повтора (разброс)' Число иэучеиимк взлелей" 5 — 16 12,2 — 51,2 3 — 14 4 — 16 10 — 25 8 — 21 7 — 18 5 — 16 7 — 20 5 — 16 5 — 16 7 — 39,2 12 — 41,2 Источник: из Впйег, [.М. (2005) гллеиж 0ФА Туртб 2пг) ейп, Асж1епнс Ргезз, 5ап Вйейо, р.
96. ' Длина повторов в человеческой популяции. В некоторых аллелях могут встречаться час- тичные или неточные повторы. " Число разных аллелей в человеческой популяции, изученных на данный момент. Тщательный анализ локусов многих людей — необходимое условие для использования ДИК-типироваиия в криминалистике. С5Г1РО ЕСА ТН01 ТРОХ ЛЧА 0351358 055818 В75820 В851179 В135317 В165539 В18551 В21511 Агпе!ойеп(п 5 11 2 12 3 5 7 8 13 16 18 21 Х,'г' ТАСА СТТТ ТСАТ СААТ [ТСТС[[ТСТА[ [ТСТСЦТСТА[ АСАТ САТА [ТСТА[[ТСТС[ ТАТС бАТА АСАА [ТСТА[[ТСТС[ Неприменимо 20 80 20 15 28 24 15 30 17 17 19 51 82 а Связанный с красителем ПЦР-праймер Сканирование пиков продуктов ПЦР нз покуса )375820 ПЦР-фрагменты разгоняют в капилляре с гелем 175 и.
н. 245 и. н. 315 п.н. 385 и. н. 105 и, н. 16-р1ех 1656] Часть 1. 9. Технологии на основе информации из ДНК повторов) н в человеческой популяции могут нмсть разную длину. В геноме человека охарактеризовано свыше 20 000 тетрацуклеотидных повторов. По оценкам, всего в геноме человека может содержаться свыше миллиона ВТК различных типов, что состанляет около 3% всей геномной ДНК.
В анализе ЯТК применнют полныеразную цепную реакцию. В судебной практике уже давно (в начале 1990-х гг.) стало очевидным преимушество анализа Аллель 2 ЯТК-послеловательг1ости Амплнфикзцня 5ТК по сравнению с анализом полнморфизма длины рестрикционных фрагментов в связи с более высокой чувствительностью метода Последовательности ДНК, ограничивающие БТК, уникальны для каждого типа повтора и идентичны (за нсклкгченнем очень редких мутаций) у всех людей. Для ПЦР используют праймеры, связываюшнеся с этими последовательностями и позволяющими амплифицнровать ДНК тандемного повтора (рнс. 2, а). Таким образом, длина продукта 1РЦР соотвст- Рис. 2.
ПЦР-анализ покусов 5ТК. а) Праймеры для ПЦР сконструированы таким образом, чтобы амплнфнцнровать фрагмент ДНК содержащий повтор. Один нз двух праймеров связан с флуоресцентным красителем (зеленый кружок). Две хромосомы человека могут иметь различные вплели, с разным числом повторов в одном и том же покусе. Поэтому в результате проведения ПЦР могут образоваться два продукта слегка различающегося размера. Эти продукты разделяют с помощью очень тонкого полиакриламидного геля в капиллярной трубке, Образующиеся флуоресцентные полосы анализируют с помощью прибора и получают набор пиков.
При сравнении этого набора с марнерами удается определить размер каждого продукта ПЦР и, следовательно, длину 5ТК соответствующего аллеля. 6) Сочетание продуктов ПЦР от нескольких покусов создает сложный рисунок, как тот, что изображен здесь. (В данном случае это коммерческий набор для анализа 5ТИ, содержащий последовательности из 16 покусов, так называемый 16-р(ех.) Для такого анализа нужно несколько наборов праймеров — по одному набору для каждого покуса.
Для облегчения идентификации покусов праймеры связаны с метками различного цвета. Кроме того, ПЦР-праймеры для каждого покуса подобраны таним образом, чтобы диапазон размеров получающихся продуктон отличался кан можно сильнее от тех, что получаются с другими праймерами. ствует ллипс тандемного повтора в образце. Поскольку каждый человек наследует по одной хромосоме в парс от каждого родителя, ллины тандемных повторов на двух хромосомах час~о различны, в резулыате чего при аналнзс ДНК одного человека получают два сигнала. Если анализировать участки 5Тй„расположение полос, получаемое прн снятии отпечатков ДН К, индивидуальио для каждого человека Метод ПЦР позволяет исследователям получать отпечатки из ДНК массой менее 1 эг, даже частично разрушенной, например из слинственэого волосяного фоллнкула, капли крови, небольшого количества спермы, найденной на жертве изнасилования, нли из образцов ДНК давностью в несколько месяцев или лаже лет.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
