Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 143
Текст из файла (страница 143)
соб становятся все более попятными, исследователи уже могут манипулировать клетками для экспрессии клонированных генов с целью изучения их белковых продуктов. Болыпинство генов эукариот лишены элементов послеловательности ДНК, необходимых для их экспрессии в клетках Е. со11 (таких как промоторы — последовательности, указывающие ДНК-полимеразе места связывания).
Поэтому в подходящие для эукариотичсских генов места в ДНК вектора должны быть помещены бактериальные регуляторные последовательности транскрипции и трансляции. Промоторы, регуляторные последовательности и другие аспекты регуляции генной экспрессии обсуждаются в гл. 28. В некоторых случаях клонированные гены экспрессируются так эффективно, что их белковый продукт составляет более 10% всего клеточного белка; тогда говорят, что они гиперэкспрессированы. При таких концентрациях некоторые чужеродные белки могут убить клетку Е. сой, так что экспрессию гена надо ограничить несколькими часами до сбора клеток. Клонируюшие векторы с сигналами транскрипции и трансляции, необходимыми для регулируелюй экспрессии клонированного гена, часто называются экспрессирующими векторами.
Скорость экспрессии клонированного гена контролируется при замене собственных промоторных и регуляторных последовательностей гена на более эффективные и подходящие варианты, предоставляемые вектором. Как правило, хорошо охарактеризованный промотор и его регуляторные элементы располагаются вблизи нескольких специфических участков рестрикции, используемых при клонировании, так, чтобы гены, вставляемые по этим участкам, экспрессировались регулируемым про- Известная амннокнсдотная Нзй — — — С1у — Еец по следовательно оп Возможные (5')ССА ПСА кодоны С С С ППС ССП СНА ССС СПС СПП СПС Рго Ттр С)ц Азр — Мех Ттр — Р)се Чз1 — Агн — — — СОО ССА [ПСС САА САС АСС ПСС ППС СО[А АОА(3) ССС, 'САС САП ПОП ОП[С АСС ССП[ СП[П ССА ССС,' ОП[С ССС Участок с минимальным вырождением Сннтетнческаа ПСС СА СА АСС ПСС ПП СП метка С П 20 нуклеотндов а дзицу, 8 возможных последовательностей Рис.
9-9. метка для определения гена, нодирующяго белок с известной нуклеотидной последовательностью. Нз-за того что более одной последоаательнопи ДН К пожег кодировать любую данную аминокислотную последовательность, говорят, что генетический код «аырожден» (об этом говорится а гл. 27; каждая аминокислота кодируатсл набором из трех нуклеотидоа — кодоном. Большинству аминокислот соотаетпвуют два или более кодовое; см. рис. 27-7). Таким образом, искомая последовательность ДНК для известной аминокислотной последовательности не может быть заранее определена.
Зонд проектируется так, чтобы быть комплементарным участку гена с минимальным «вырождением», т. е. участку с иинимальным числои возможных кодоноа для аминокислот; а приведенном здесь примере не более двух кодоноа. Олигонуклеотиды синтезируются с селектиано рандомиэироаанными последовательностями, так что они содержат один из двух возможных ну«пептидов а каждом месте потенциального вырождения (окрашены а розовый цвет). Приведенный здесь олигонуклеотид представляет собой совокупность из восьми различных последовательностей, при этом одна из них полностью комплементарна гену, а есе восемь амепе соответствуют, по крайней мере, 17 из 20 позициям. Седектирующий генетический маркер(например,устойчивость кацтнбнотнкам) моторным элементом (рис.
9-10). 11скоторые нз таких векторов нклвча(от н себя и другие характерные участки, например место связывания бактериальной рибосомы для улучшсния трансляции мРНК, полученной с гена, или последовательность окончания транскрипции. Гены можно такжс клонировать и экспрсссировать в эукариотнчсских клетках; обычно в качестве хозяев используют различные вилы дрожжей. Эукариптический хозяин иногда может осущсст- Ркс. 9-10.
Последовательности ДНК в типичном экспрессирующем венторе Е. соН. Экспрессируемый ген зстааллется на одном из участков рестрикции полилкккера вблизи промотора (Р) так, чтобы ближайшим к промотору был конец, кодирующий Н-концевую амикохислотную последовательнопь. Промотор способствует эффективной транскрипции вставленного гена, а последовательность терминатора транскрипции иногла увеличивает количество и стабильнопь получаемой кРНК. Оператор (0) осуществляет регуляцию с помощью репрессора, который связывается с ним (гл.
28). Участок ажзыаания рибосомы обеспечивает сигналы, необходилые лля эффективной трансляции мРНК, полученной от гека. Селектируемый маркер позволяет отобрать клетки, пнержащие рекомбинантную ДНК. 9.1 Клонирование ДНК: основные понятия [445[ влять посттрансляциопныс модификации (изменения в белковой структуре, )сроисхпдяп(ие после синтеза на рибоспмах), которые могут потребоватьгя для функционирования клопированного белка зукариот. Последовательности бактернальцых проыоторх (Р) н оператора (О) Палнлнцхср со спецнфнГец, кодирующий ческимн участками лдн Рспп«ссор, который: нескольких эндонуклезз связывается с О Рестрикции (т.е. клоцирун регулирует Р ющне сайты) "г О' 4) к'.') уч,„.
„„,, 4Ь Последовательность окоцчзцнл ) цнс ~-,~~сы; ' транскрипции Рскомбинзнтнзя нлззмндпзя ДНК Одна цепочке рекомбннзнгной ш«ззмндной ДН К Ген !'сн «ооукягязм «рококо яигонуклеогид изменением я оследовзтель- ости гц 1К-о««.оо««т«««««к дмтГ«, Л!!к .оного Сннгегнчес фрагмент Д со снецнфи ческнм нзм нием в паре оснований лцк-.
Плззмндз, содержащая ген с желаемым изменением о парс оснований. а зосформяяия сток Е со!!Г оарзцкя ДН К ~ч46! Чапъ1. 9. Технологии на основе информации нз ДНК Изменения в клонированных генах приводят к получению модифицированных белков Технологии клонирования можно использовать нс только лля получения больших количеств белка, но и лля синтеза белковых продуктов, слегка отличающихся от их природных форм. Специфические аминокислоты можно заменять по отдельности, используя свйт-специфичный мутагенез.
В этом мощном методе изучения строения и функций белка производят изменение аминокислотной последовательности путем модификации послеловательности ДНК в клонируемом гене. Если подхолягцие участки рестрикции расположены по обе стороны от молифицируемой нуклеотидной последовательности, тогда исследователи могут просто вырезать сегмент ДН К и заменить его синтетическим аналогом, идентичным оригиналу за исключением желаемого изменения (рис. 9-11, а).
В том случае, если удобно расположенных участков рестрикции нет, можно произвести изменения в специфической ДНК-последовательности при использовании подхода, называемого олигонуклеотид-направленным мутагенезом (рис. 9-11, 6). Короткая синтетическая цепочка ДНК со специфическим изменением в основании гибрилизуется с олноцепочечной копией клонируемого гена в полходящем векторе. Несоответствие одной пары оснований на 15 — 20 пар не препятствует гибрилизации, если это происходит при подхолящсй температуре.
Эта цепочка служит праймером лля синтеза цепи, комплемеитарцой плазмилному вектору. Затем такая двойная рекомбинантная плазмила с небольшим несоответствием (мисматчем, от англ. тгзтлагсл) используется лля трансформации бактерий, в которых мисматчи исправляются клеточными ферментами репарации ДНК (гл. 25). Около половины актов репарации будут удалять и заменять модифицированное основание, возвращая ген к его исходной последовательности; другая половина удалит и заменит нетронутое основание, сохраняя желаемую мутацию. Трансформированные клетки тщательно проверяются (часто ссквенированием их плазмилной ДНК), пока не будет найдена бактериальная колония, солержащая плазмиду с измененной последовательностью.
Изменения можно также осуществить более чем в олной паре оснований. Болыпие участки гена могут быть удалены вырезанием сегмента В клетках Е. сову примерно половины плззмид будет ген с желаемым нзменением в пзреоснояаннй. Рис. 9-11. Два падхвда к сайт-специфичнвму мугагенезу. а) Синтетический сегмент ДНК заменяет фрагмент ДНК, ноторый был удален вырезанием зидонухлеазой рестрикции. 6) Синтетический олнгонуклестнд с желаемым изменением последовательности в одном месте гнбрндизуется с одноцепочечиой копией моднфнцнруемого гена н действует нах затравка для синтеза двухцепочечиой ДНК (с одним мнсматчем), которая затем используется для трансформации клеток. Репарирующне системы клеточной ДНК исправляют около 50'Ь несоответствий, отражая желаемое изменение в иухлеотндлой последовательности.
9.1 КяонировэниеДНК! основные понятия 1447( Концевые последовательности обеспечивают участки связывания для аффинной хроматографии Аффипная хроматография является одним из наиболее эффективных методов очистки белка (см. рис, 3-17, в). К сожалению, для многих белков не найдено лигандов, которые можно было бы имиобилизовать на твердом носителе для провелепия хроматографии. Создание слитых белков делает возможным проводить очистку методом аффинпой хроматографии практически любого белка. Сначала созлают конструкцисо ДНК, в которой ген искомого белка соединен с геном, кодирующим пептид или белок, связывавщийся с т<и. << игитид Л1ииииж!иянин.
Илсиибк>ииииии!ии!< Ил<Ил,!<ДИ .<И>ИИИ 59 Ес-у <эс<ок 1>СС< 08 ' ХР' Велик А (В>И)и «><и!лзи>п 9! ран< ф! ри:я Ь!<>1><><У'О<'П .">Ы Ы<Ю ПЭ1Н' ОСЛОЛ йпа>Ив<ХИ>,1!МИ 1си !юное Х!И>!с!«И< И Л Л 1 1 ! И О ф Е ! П Л Р-1Ь ! по!я- ЛИК!'П:И1ЛИЭИ (ТРЕП) Х>пмп Хю'и !и'пй.<ы и!!и<- пней м>мси эндонуклеазами рестрикции и сшиванием оставшихся частей с образованием меньшего по размерам гена. Части двух различных генов можно сшить, образуя новые комбинации. Продукт такого смешанного гена называется слитым белком (фьюжн-белком).
Теперь исследователи располагают оригиназьными метолами для осуществления практически люГ>ого генетического изменения !и с!!Тго. Встраивание измененной ДНК в клетку позволяет изучать результаты такого изменения. Сайтспецифичный мутагенез чрезвычайно продвинул исследование белков, поскольку дал возможность ученым производить специфические изменения н первичной структуре белка и изучать эффекты таких изменений на конформацию, трехмерную структуру и активность белка. высокил> сродством и специфично с известным лигапдом. Псптил или белок, используемый для эп>й цели, присоединяется к 1ч- или С-концу; его называют концевой последовательностью, пли тэгом (от англ. гад — метка, ярлык). В табл.
9-3 перечислены некоторые белки и пептиды, наиболее часто используемые в качестве концевых последовательностей, а также их лиганды. Ход эксперимента проиллвстрирован на примере присоединения к выделяемол>у белку последовательности глутатион-В-трансферазы (ГСТ). ГСТ вЂ” небольшой фермент (М, = 20 000), который с высоким сродством и «пепифичностью связывается с глутатионолс (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
