Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 144
Текст из файла (страница 144)
9-12). Если создать конструкцию, в которой геп ГСТ слит с геном искомого белка, такой химерный белок приобретет способность связывать глутатион. Химерный белок экспрессируют в бактериальных или других клетках, а затем готовят грубый клеточный экстракт. Хроматографическую колонку заполняют пористым посителел1, представляющим собой микроскопические шарики из стойкого полимера (например, из перекрестпо-сшитой агарозы), на котором иммобилизован лиганд (в данном случае глутатион). Все другие белки из экстракта проходят через колонку, пе связываясь с носителем. ГСТ прочно связывается с глутатионом, но связь эта пековалснтная, поэтому белок легко можно смыть с колонки с помощьк> раствора, содержапсего либо высокув концентрацию соли, либо свободный глутатион, который конкурирует с иммобилизованным лигапдом за связывание с ГСТ.
Таким путем часто удается получить очищенный белок с высоким выходом. Иногда концевую последовательность частично или полностьв отделяют от очищенного белка с помощью протеазы, которая расщепляет последовательность в области связывания с глутатионом. Примером короткой концевой последовательности, которая находит множество применений, может служить простая последовательность из шести или большего числа остатков гистидина (бхН!з).
Эта последовательность с высоким сродством и специфичностью связывается с ионами никеля. Колонка с иммобилизованными ионами никеля может применяться для эффективного отделения белка с гистидиновой последовательностью на конце от остальных белков в смеси. Более крупные концевые последовательности, такие как мапьтозосвязывающий бе- ]448] Часть1. 9.
Технологии на основе информации наДНК Глутатногг-5-траггсфераза (ГСТ) б Ген вылслнемого беака Ген слнтопг белка Г Э» Э» Экснрссснв слнтого ' Э» белка в клетке. Э» готовленнс экстракта клеток, ржашего слитый белок в н клеточных белков. Глутатнон ( ;"- ",сввзывастсл ' тра,'-.:.'яз.( «через ГСТ. ' '~~ ( (4$,"!' сквозь !еарз «ай дй' колонку. (,"",~,,,й,;: , ж* Нанес белков на х фнческу еннс см ромато ю коло Вымывание слитого белка. Рис. 9-12.
Использование химерных конструкций для очистки целевого белка. В качестве примера рассматривается очистна белка. слитого с глутатнон-Б-трансфераэой (ГСТ). а) ГСТ представляет собой небольшой фермент (изображенный здесь а виде кружка фиолетового цвета), который связывает глугатион. (Глутатнон — тринептнд т-глутамющистеиннлглнцнн, содержащий необычную пептндную связь между аминогруппой цнстенна н углеродом нарбонсильной группы боковой цепи глутамата.) б) ГСТ присоединяют н С-нонцу выделяемого белна генно- инженерным методом.
Химерный белок энспресснруется в хозяйской клетке н присутствует в грубом экстракте после лиэиса клеток. Экстракт наносят на хроматографнчесную колонку с носителем, на котором нммобнлнэован глутатион. Химерный белон связывается с глутатноном н задерживается на колонке, тогда нак остальные белан быстро вымываются. Химерный белок затеи смывают с колонки с помощью раствора содержащего высокую концентрацию соли нли свободный глугагион.
лок, могут улучшить растворимость и повысить устойчивость выделяемых белков, что позволяет выделять белки, которые нс удается выделять другими методами. Методы с использованиеги концевых последовательностей удобны и аффективны, что объясняет их очень гпирокое распространение. Однако в этой работе следует проявлять определенную осторожность.
Дело н том, что концевые последовательности не являются инертными. Даже очень небольшие последовательности могут изменять свойства белков, к которым они прикреплены, и влиять нв результаты эксперимента. Активность белка может измениться даже после удаления концевой последовательности с помощью протеазы, например если один или несколько аминокислотных остатков остаются связанными с выделяемым белком. Экспериментальные результаты, полученные таким методом, всегда следует оценивать с помощью хорошо продуманного контроля, чтобы учесть влияние посторонней последовательности на функции изучаемого белка.
Краткое содержание раздела 9.1 КЛОНИРОВАНИЕ ДНК: ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ° В клонировании ДНК и генной инженерии используют разрезание ДНК и объединение сегментов ДНК в новую комбинацию — рскомбнпантную ДНК. 9.2 Оггеновкгеномам 14491 ° Клонирование подразумевает разрезание ДНК ферментами на фрагменты; выбор и возможность модификации иптересующсго фрагмента; вставку фрагмента ДНК в подходящий клониру>ощий вектор; перенос вектора со вставленной в него ДНК в клетку- хозяина для репликации; идентификацию и отбор клеток, содержащих фрагмент ДНК. ° Ключевые ферменты в клонировании гена— эндонуклеазы рестрикции (особенно ферменты типа П) и ДНК-лигаза. ° Клонирующими векторами являются плазмиды, бактериофаги, для самых длинных вставок ДНК вЂ” искусственныс бактериальные хромосомы (ВАС) и искусственные хромосомы дрожжей ( г'АС).
° Клетки, содержащие определенные последовательности ДНК, можно идентифицировать методами ДНК-гибридизации. ° Методы генной инженерии манипулируют клетками для экспрессии и/или изменения клонируемых генов. ° Белки или псптиды могут быть геппоинженерным методом связаны с целевым белком, в результате чего образуется химерный белок. Дополнительный пептидный участок может быть использован для обнаружения целевого белка или лля его очистки методом аффинной хроматографии. 9.2.
От генов к геномам Современная научная дисциплина геиомика па сегод>ишний день позволяет изучать ДНК в масштабе клетки, от отлельных генов до полного генетического комплекта организма — его генома. Геномные базы данных быстро растут по мере того, как завершается очередной этап секвенирования. Биология в ХХ1 в. будет продвигаться с помощью информационных ресурсов, что всего несколько лет назад было даже трулно себе представить. Теперь обратимся к рассмотрению некоторых технологий, лежащих в основе такого прогресса. Библиотеки ДНК представляют собой специализированные каталоги генетической информации Библиотека ДНК представляет собой собрание ДНК-клопов, объединенных вместе в качестве источника ДНК для секвенирования и идентификации гена или изучения его функций.
Библиотеки могут быть нескольких типов в зависимости от источника ДНК. Одной из самых больших библиотек ДНК является геномная библиотека; данные для нее получают при разрезании целого генома какого-то организма на тысячи фрагментов; все эти фрагменты клонируются путем их вставки в клонирующий вектор. Первый шаг в получении геномной биГ>лиотеки — частичное расщепление ДНК энлонуклеазами рестрикции, так чтобы любая ее последовательность встречалась во фрагментах определенного диапазона длин — диапазона, совместимого с клонирующим вектором и гарантирующего присутствие практически всех последовательностей в клонах библиотеки. Слишком большие или слишком малые для клонирования фрагменты удаляются центрифугированием или электрофорезом.
Клонирующий вектор, такой как плазмида ВАС или УАС, разрезается такой же эндонуклеазой рестрикции и лигируется вместе с геномными фрагментами ДНК. Совокупность связанных таким образом ДНК затем используется для трансформации бактериальных или дрожжевых клеток, образуя библиотеку типов клеток таким образом, что каждый тип песет в себе разную рекомГ>инаптную молекулу ДНК. В идеальном случае вся ДНК в изучаемом геноме представлена в библиотеке. Каждая трансформированная бактериальная или дрожжевая клетка образует колонию, или «клон», идентичных клеток, причем каждая клетка включает в себя одну и ту же рекомбинантную плазмиду, одну из многих, представленных во всей библиотеке.
Используя методы гибридизации, исследователи могут упорядочить отдельные клоны в библиотеке, идентифицируя клоны с перекрывающимися последовательностями. Набор перекрывающихся клонов представляет собой каталог элементов протяженного сегмента генома и часто называется контигом (рис. 9-13). Установленные ранее нуклеотидные последовательности целых генов можно найти в библиотеке методами ВАС-клоны го<ля::П:П ПГП<ППП АААААААА 3'ТТТТТТ'ГТ Обратная транскрнптаза н ЖТР приводят к образо ванию комплемептарной нити ДНК мРНК-ДНК-гибрид 5' мРН К разрушается шелочью 5' 3' Двухцепочечная ДНК 5' 3' 1456] Часть 1. 9.
Технологии на основе информации из ДНК Сегмент хромосомы из организма Х А ВСП вР СН 1 1 К Ь М<<<0 РСГ 6 П<ППХХ Ш<с < пл<з<шю ППШ<П ° ПП<ППП~ 1~~ Рнс. 9-13.упорядочение кленовабиблиотенеДНК.Представлен сегмент хроиосоиы гипотетического организма Х с маркерами от А до О, изображающими последовательно-меченные сайты (5Т5 — участки ДНК с известными нуклеотидными последовательностями, включая известные гены).
Под хромосомой изображен набор упорядоченных ВАС-клонов с номерами от 1 до 9. Упорядочение клонов на генетической карте является многостадийным процессом. Присутствие или отсутствие 5Т5 в отдельном клоне можно определить гибридизацией — налрииер, зондированием каждого клона ДНК, полученной из 5Т5 с помощью ПЦР. Как только все 5Т5 в каждом ВАС-нлоне идентифицированьь клоны (и сами 5Т5, если их местоположение еще не известно) можно расположить на карте в определенном порядке. Например, сравним клоны 3, 4 и 5. Маркер Е (синий) обнаружен во всех трех клонах; Е (красный) в клонах 4 и 5, но не в 3; и 6 (зеленый) только в клоне 5.
Это означает порядок следования сайтов Е, Е б. Клоны частично перекрываются и их очереднос<ь должна быть 3, 4, 5. Конечный упорядоченный набор клонов называется контигом. гибридизации, определяя, какие именно клопы в библиотеке содержат в себе искомую последовательность. Если же последовательность уже была картирована на хромосоме, то исследователи могут определить местонахождение (во всем гсномс) клонированной ДИК и любого контига, частью которого она является. Хорошо организованные библиотеки могут содержать тысячи длинных контигов, относящихся к определенным хромосомам и упорядоченных в соответствии с ними, образуя подробную гсномную карту.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
