Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 145
Текст из файла (страница 145)
Известные последовательности в библиотеке (каждый из которых называется последовательно-меченным сайтом, или ЯТЯ; от англ. ведиепсе-Тощего Ые) могут с~ать ориентирами для проектов по расшифровке гсномов. Ио мере того как все болыпе и больше пуклсотидных последовательностей генома становятся доступнь<ми, использование гсномных библиотек постепенно убывает, и исследователи создают более специализированные библиотеки, предназначенные для изучения функций генов.
В качестве примера можно привести библитотску, которая включает только те гены, которые экспрегсируюглся, т. с. трапскрибируются в РНК, в данном организме или в определенных клетках или тканях. В таком б<анкс нет нскодирующих послсдоватсль- Матрица мРН К соединяется с синтетическим олнгонукпео тидным (оййо <)Т) праймером 3' , 'Т Т Т. Т Т Т Т '1 ТТТТТТТТ Чтобы начать синтез второй цепи, обычно 3'-конец кДН К лигнруют с известной олигонуклеотидной последо- вательностью ДНК-полимераза н <ПЧТР удлинняют последователь- ность, начиная с праймера, образуя двухцепочечную ДНК Т Т Т Т Т Т Т.Т Рис.
9-14. Создание библиотеки кДНК из мРНК. мРНК клетки состоит из транскриптов тысяч генов, и образующиеся ПДНК гетерогенны. Получаемая таким методом двойная цепь ДНК помещается в подходящий клонирующий вектор. Обратная транскриптаза может синтезировать ДНК на РНК- или ДНК-матрице (см. Рис. 25-33). 9.2 От генов и геномам (451) настей, которые составляют значительную часть многих геномов эукариот.
В первую очередь выделяют мРНК из организма или из его специфических клеток, а затем из РНК получает комплементарные ДНК (кДНК) в многосталийной реакции, которую катализирует фермент обратная транскриптаза (рис. 9-14). Получившиеся в результате фрагменты лвухцепочечной ДНК затем помсщанц в подходящий вектор и клонируют, образуется популяция клонов нол названием библиотека кДНК. Поиск определенного гена становится лсг- Вставка ОРР кЛНК ВККВ1~ВВК::Л Вставка Эпнтопяая ЛНК о+ О + Экспрессия меченого белка и клетке. Получение экстракта нз клетки. М Осзжление Разлеленне ' ~ белка белхоп..' четким ~ч~ аятителом. Оселок идентификация неизвестных белков в осадке (например, масс-еоектрометрией).
Гио 9-15. Специализированные библиотеки ДНК. а) Клонирование кДНК вблизи гена зеленого флуоресцентного белка (6РР) создает сигнальную конструкцию. В интересующем (вставив ДНК) н сигнальном генах происходит транскрипция РНК, а затем из мРНК-трансирнптз получается слитый белок, 6РР-часть которого видна з флуоресцентном микроскопе.
На фотографии показан хеуглый червь содержащий 6РР-слитый белок, который проявляется только в четырех местах на его теле. й) Сигнальные нонструкции б) Если нДНК илоннруется вблизи гена зпитопной метки, получающийся слитый белок можне осадить антнтеламн и зпнтопу. Любые другие белки, хеторые взаимодействуют с меченым, также осаждаются, помогая объяснять белок-белковые взаимодействия. че при обращении к библиотеке кДН К, образованной из мРНК клетки, когда известно, что данный ген эксирессируется.
Например, если бы мы решили клонировать гены глобина, то вначале пришлось бы создать библиотеку кДНК из клеток- предшественников зрит(юцитов, в которых около половины мРНК кодируют глобины. Чтобы облегчить картирование больших геномов, кДНК в библиотеке можно частично секвенировать в произвольном порядке лля образования полезного типа ЯТБ, названного меткой экспрессируемой последовательности (ЕЬТ, от англ. ехргеяее( ледиепсе Йгк).
В диапазоне длин от нескольких лесятков ло сотен пар оснований можно расположить ЕВТ на карте большого генома, предоставляя, таким образом, маркеры экспрессируемых генов. Сотни тысяч ЕВТ нанесены на подробные геномные карты; они использовались в качестве ориентиров при расшифровке генома человека. Библиотеку кДНК можно сделать лаже более специализированной, клонируя кДНК или фрагмент кДНК в вектор, в котором кДНК- последовательность соединяется с последовательностью маркера или сигнального гена; соединенные гены образуют «сигнальную конструкциюь.
Двумя подходящими маркерами являются гены зеленого флуоресцентного белка и эпитоппые метки. Исходный ген, соединешзый с геном зеленого флуоресцентного белка ( ИГР, от англ. Кгеепу)иоевзсепг ргоге)п), приводит к образованию слитого белка, который чрезвычайно флуоресцентен— он буквально светится (рис. 9-15, а).
Зеленый флуоресцентный белок (СГР) из медузы Аешхогеа глсгопа имеет структуру 13-бочонка, внутри которого находится флуорофор (см. лоп. 12-3, с. б12). Флуорофор образуется в результате перегруппировки и окисления нескольких аминокислотных остатков в автокаталитической реакции, лля которой требуется только молекулярный кислород (см. доп. 12-3, рис. 3). Поэтому этот белок легко клонировать в активной форме практически в любой клетке.
Всего нескольких молекул белка достаточно, чтобы увидеть их под микроскопом; это позволяет следить за его перемещениями в клетке. Методом белковой инженерии удалось получить мутантные формы белка, способные светиться другими цвегами и обладаюп1ие некоторыми другими свойствами (яркостью, стабильностью). Кроме того, несколько родственных белков были недавно выделены из других видов организмов.
1452] Часть 1. 9. Технологии на основе информации из ДНК Эпитопная метка представляет собой короткую белковуго последовательность, которая крепко связывается хорошо изученным моноклональным антителом (гл. 5). Меченый белок можно специфически осадить из общего белкового экстракта взаимодействием с антитслом (рис.
9-15, б). Если етце какие-нибудь белки прикрспятся к меченому, то они также будут осаждены, предоставляя информацию о белок-белковых взаимодействиях в клетке. Разнообразие и практичность специализированных библиотек ДНК растут с каждым ~одом. Полимеразная цепная реакция амплифицирует специфические последовательности ДНК Проект «Геном человека» вместе с другими подобнымп попытками секвенирования гепомов организмов любого вида обеспечивает беспрецедентный доступ к генетической информации. Это, в свою очередь, упрощает процесс клонирования отдельных генов для более детального биохимического анализа.
Если известна нуклсотидная последовательность, но крайней мере, фланкирующих частей клонируемого сегмента ДНК, то можно значительно увеличить число копий такого сегмента, применив полимеразную цепную реакцию (ПЦР) — метод, созданный Кэри Маллис в 1983 г. Амплифицироваттную ДНК можно сразу клопировать или использовать во многих аналитических процедурах. Метод ПЦР исключительно прост. Подготавливаются два синтетических олигонуклеотнда, комплементарные последовательностям на противоположной цепи ДНК прямо перед концами амплифицируемого сегмента. Олигопутотеотиды служат праймерами для репликации ДНК-полимеразой.
3'-Концы гибридизованных зондов направлены друг к другу и размещены для затравки синтеза ДНК по всему данному сегменту (рис. 9-16). (ДНК-полимеразы синтезируют нити ДНК из дезоксирибонуклеотидов, используя ДНК-матрицу; подробно об этом говорится в гл. 25) Выделенная ДНК, содержащая амплифицируемый сегмент, нагревается на короткое время для денатурации, а затем охлаждается в присутствии большого избытка синтетических олигонуклеотидных праймеров. Затем добавляются четыре типа дсзоксинуклсозидтрифосфатов, и сегмент ДНК с праймером избирательно реплицируегся. Цикл нагревания, охлаждения и репликации повторяется 25 пли 30 раз в течение нескольких часов в ходе автоматизированного процесса, амплифицируя сегмент ДНК, ограниченный праймерами, до тех пор, пока его можно будет без труда анализировать или клонировать.
В методе ПЦР используется термостабильная ДНК-полимераза, например Тат)-тголихтераза (полученная из бактерии, живущей при 90 'С), которая остается активной после каждого нагрева и не нуждается в замене. Тщательная разработка праймеров, используемых при ПЦР например включение участков разрезания эндонуклеазой рестрикции, может способствовать дальнейшему клонированикт амплифицированной ДНК (рис. 9-16, б). Эта технология очень чувствительна: с помощью метода ПЦР можно обнаружить и амплифицировать вплоть до одной молекулы ДНК практически в любом образце. Хотя ДНК и деградирует со временем (с.
415), ПЦР позволяет удачно клонировать ДНК из образцов возрастом более 40 000 лег. Исследователи применили эту тсхнологито для клонирования фрагментов ДНК из мумифицированных останков людей и вымерших животных, например мамонта; таким образом появились новые направления в молекулярной археологии и молекулярной палеонтологии. ДНК из мест обнаруженных захоронений амплнфицировали с помощью ПЦР а затем использовали, чтобы проследить миграции древнего человека. Эпилемиологи могут использовать образцы ДНК из человеческих останков, полученные методом ПЦР для наблюдения за эволюцией патогенных вирусов человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
