Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 149
Текст из файла (страница 149)
Сохраняющееся расположение генов, называемое синтенией, еще раз свидетельствует об ортологической связи между генами на одинаковых участках родственных сегментов. С другой стороны, последовательности, связанные с определенными структурными мотивами белка (гл. 4), можно выявить в нем самом. Присутствие структурного мотива может означать, что белок, скажем, катализнрует гидролиз АТР связывается с ДНК или образует комплекс с ионами цинка, что помогает определить молекулярную функциях Такие связи определяются с помощью постоянно совершенствующихся компьютерных программ, и лимитирует этот процесс только имеющаяся информация о гене и структуре белка и наша способность связать последовательности с опрелеленнымн структурными мотивами. Для установления функций па основе структурных взаимосвязей был начат широкомасштабный проект по структурной протеомике. Цель его 9.3 От геномов к протеомам 1463! заключается в кристаллизации и определении структуры как можно болыпего числа белков и белковых доменов, зачастую обладая минимальной или вообще не имея никакой информации об нх функции.
Проскту способствовала автоматизация некоторых утомительных этапов кристаллизации белка (см. доп. 4-5). Как только выясняется структура, она становится доступной в базах данных структур, о которых п>ворилось в гл. 4. Такой подход должен помочь определить степень вариации структурных особенностей.
Если выясняется, что у только что открытого белка в структуре имеются элементы„которые однозначно напоминают структурные мотивы с известной функцией из базы данных, то на основе этой информации можно предположить молекулярную функцию такого белка. Паттерны клеточной экспрессии когут прояснить функцию гена в клетке В каждом вновь расшифрованном гсноме исследователи находят кодирующие белки гены, не имеющие однозначных структурных взаимосвязей с уже известными генами или белками.
В этих случаях лля получения информации о функции гена можно использовать другие подхолы. Выяснение того, в каких тканях экспрессирустся ген или при каких условиях происходит образование гсшюго продукта, может снабдить нас драгоценными ключами к разгадке. Для изучения таких паттернов было разработано много разных методик. Двумерный гель-электрофорез. Как показано на рис. 3-21, с помощью двумерного гсльэлектрофорсза можно обнаружить и разделить до 1000 различных белков в одном геле.
Затем можно использовать масс-спсктрометрию (см. лоп. 3-2), чтобы частично определить области отлельных белков и сопоставить каждый белок с соответствующим ему геном. Помочь определить функцию гена в клетке может появление и нс появление (или исчезновение) областей определенных белков в пробах из различных тканей, из одинаковых тканей на разных этапах развития или из тканей, обработанных способами, имитирующими множество биологических условий. На таких гелях одновременно можно увидеть большое количество различных белков, поэтому данный метод используется в системной биологии. Например, патогенная бактерия может измениться таким образом, что станет устойчивой к действию одного или нескольких антибиотиков.
Существует высокая вероятность того, что белковый состав такой бактериальной клетки изменится. ДНК-микрочнпы. Основные усовершенствования технологии, лежащей в основе библиотек ДНК, ПЦР и гибридизации, объединились при создании ДНК-микрочипов (называемых иногда просто ДНК-чипами), которые позволяют осуществлять быстрый и одновременный скрининг нескольких тысяч генов.
При использовании автоматизированных устройств, которые очень точно наносят нанолитровые количества раствора ДНК, сегменты ДНК известных генов длиной от нескольких десятков до сотен нуклеотидов амплифицируют с помо>цью ПЦР и помещают на твердую подложку. В специально разработанном чипе на площади поверхности всего в несколько квадратных сантиметров размещается ло миллиона таких капель. При алыернативном подходе ДНК синтезируется непосредственно на твердой подложке с использованием фотолитографии (рис. 9-21). После приготовления чипа его можно зондировать с помошьк> мРНК или кДНК из определенного типа клеток или клеточной культуры для идентификации генов, которые в пих экспрессируются.
Использование микрочипов позволяет ответить на вопросы о том, какие гены экспрессируются па каждой стадии развития организма. Из клеток на лвух разных стадиях развития извлекают полный набор мРНК и преобразуют в кДНК с помощью обратной транскрнптазы и флуоресцснтно меченных дезоксирибонуклеотидов. Флуоресцентные кДНК смешивают н используют в качестве зондов, кажлый из которых гибридизуют с комплементарными последовательностями на микрочипе.
Например, на рис. 9-22 мсчсныс нуклеотиды используя>т, чтобы кДНК для каждой пробы флуоресцировала двумя разными цветами. Затем кДНК из двух проб смешивая>т и используют для зондирования микрочипа. Точки, флуоресцирующие зеленым цветом, соответствуют мРНК, которых больп>с всего на одноклеточной стадии; те же, которые флуоресцируют красным, соответствуют последовательностям, преоб- Непрозрачный краи зэкрыпэег лэщку, оставляя ункн 1 н 3. Защита гр ца цоперхн Освещение упадает защитные группы и лунках 1 и 3.
Отмывка раствором с эктнпировзнным н защищенным А (*Ап) Защищенный А (А ) связывается с цсээшнгцсннымн участками з лунках 1 и 3. Новый непрозрачный экран оставляет незакры- тыми лунки 2 и 4. Освещение удаляет защитные группы в лунках 2 н 4. Отмывка раствором с активиропэнным н защищенным С (*Оп) зшишенныйО(О ) пязыпэется с незэщн- еннымн участками лупках 2 и 4.
Новый непрозрачный экран оставляет незакрытой лунку 4. Освещение удаляет защитные группы в лунке 4. Отмывка раствором с актнвнрованным и защищенным С (*Сп) Защищенный С(С ) вязывэется с нсзэщнценными участками лунке 4. Еще много циклоп 1464) Часть 1. 9. Технологии на основе информации из ДНК ладающим на более поздних стадиях развития. мРНК, которые присутствуют на обеих стадиях развития в одинаковых количествах, флуоресцируют желтым цветом. Используя смесь двух проб для измерения относительного, а не абсолютного избытка последовательностей, метод вносит поправки на разброс в количествах ДНК, первоначально размещенных в каждой ячейке на подложке, н на другие возможныс погрешности в ячейках па микрочипе. Флуоресцирующие ячейки дают снилюк всех генов, экспрессируемых в клетках па момент отбора образца — экспрессии генов в масштабах генома.
Что касается генов с неизвестной функцией, то время и условия их экспрессии могут дать важные сведения об их роли в клетке. Рис. 9-21. Фотолитография. В этом методе приготовления ДНК-микрочипов используются предшественники нуклеотидов, которые антивируются светом, присоединяя один нуклеотид к другому в ходе фотореакции (в противоположность химическому процессу, изображенному на рис.
8-35). В компьютер заносится информация об олигонуклеотидных последопательнопях, которые надо синтезировать в каждой ячейке на твердой подложне. Сначала антивные группы на поверхности заблонированы с помощью защитных фотоактивных групп ( ° ). Покрывающий поверхность энран открывается в тех областях поторые должны принять определенный нуклеотид. Вспышка света удаляет защитную группу в этой незакрытой области. Затем поверхность промывают раствором соответствующего антивированного нуклеотида (например, *А ), способного реагировать по своей 3'-гидроксильной группе ( ).
Защитная группа. связанная с 5'-гидроксильной группой нуклеотица, предотвращает протекание нежелательных реанций; в результате нуклеотид оказываетсн связанным с поверхностью освещенной эоны через свою 3'-гидроксильную группу. Затем экран меняют на другом, предназначенный для избирательного освещения участков, которые должны принять нуклеотид 6. Вспышна света удаляет защитные 5'-группы на ранее связанных нуклеотидах. Далее добавляют раствор *бп, и нунлеотид связывается в соответствующих местах.
Затем поверхность последовательно обрабатывают растворами двух других активированных нуклеотидов (*С и *Т ), используя селективные экраны. обеспечивающие встраивание правильных нунлеотидов в правильной последовательности. Этот процесс продолжается до тех пор, попа искомые последовательности не будут построены в наждой ячейне подложки. В наждой точке создается множество полимеров с одинаковой последовательностью, а не только один, как изображено здесь.
К тому же на подложнах располагаются тысячи ячеен с различными последовательностями (рис. 9-22), а для иллюстрации процесса на данном чипе показано всего четыре ячейки. Из клеток, нахолящнхся на двух сшлнях развития, вьщеляется мРНК; каждая проба мРНК представляет все гены, экспрес- сируемые в клетках на данной сгзлни яф ф. Преобразование мРНК з кДНК с помощью обратной грзнскриптазы с испальзова кием флуоресцентноыечен- яых дезоксирибонуклеотид- трифесфатов. | нор и ннн Чннн канн г и» клНК Добавление кДНК в микрочил; флуоресцентные кДН К прикрепляются к комллемезтарным последовательностям на микрочипе.
ДНК-ыикрочип Удаление нсгнбридизовзвщихся зондов Каждая флуорес точка соответств экспрессируем Пример микрочипа (рис. 9-23) демонстрирует впечатляющие результаты, которых можно достичь. Сегменты каждого из более чем 6000 генон полностью расшифрованного генома дрожжей были по отдельности амплифицированны с помощью ПЦР, и каждый сегмент размещался на подложке в определенном месте, образуя показанный микрочип. Этот чнп представляет собой, в некотором роде, снилюк целого генома дрожжей. 9.3 Оггеноиовкпротеомаи )465) ~ Рис.
9-22. ДНК-микрочип. Микрочип можно приготовить из любой известном последовательности ДНК из любого источника, созданного хииическим синтезом или с помощью ПЦР. ДНК размещается на твердой подложке (как правило, зто специально обработанные стеклянные пластинки) с помощью автоматизированных устройств, способных нанести очень малые (нанолитровые) капли в точные местоположения. Под действием УФ-света происходит связывание ДНК с пластинками. Как только ДНК прикрепилась к поверхности, микрочип можно зондировать другими флуоресцентно меченными нуклеиновыми кислотами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
