Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 153
Текст из файла (страница 153)
Однако они неэффективны лля клеток животных: трансформируется всего 1 из 100 †100 кзгеток. Микроинъекция — инъекция ДНК прямо в ядро при использовании очень тонкой иглы — обладает высокой результативностью в умелых руках, однако общее число клеток, которые можно обработать, невелико, потому что ДН К нужно вводить в каждую клетку по отдельности. Самые эффективные и распространенные методы трансформации клеток животных основаны па липосомах или вирусных векторах. Липосомы представляют соГюй малснькис частицы, состоящие из линидпого бислоя с заключенной внутри водой (см.
рис. 11-4). Липосомы, нссущие в себе молекулу рекомбинантной ДНК, можно слить с мембранами интересующих клеток, чтобы доставить ДНК внутрь. Иногда ДНК достигает ядра, где она может встроиться в хромосому (чаше всего в случайных положениях). Вирусные векторы еще более эффективны в доставке ДНК. У вирусов животных есть аффективные механизмы внсдепия своих нуклеиновых кислот в клетки, а у некоторых видов также имеются механизмы встраивания своих ДНК в хромосому клетки-хозяина. Некоторые из них, например рстровирусы (см. рис. 26-33) и аденовирусы, были молифицированы для работы в качестве вирусных векторов для встраивания чужсродных ДНК в клетки млекопитанпцих. Использование ретронирусов иллюстрирует рис.
9-32. При попадании специально сконструированного ретровируса в клетку его РНК-геном транскрибируется в ДНК обратной транскриптазой, а затем встраивается в геном хозяина с помощью фермента вирусной интегразы. Для такой процедуры нужны особые участки ДНК: длинные повторяющиеся последовательности на [47э) Часть 1. 9. Технологии на основе информации нэ ДНК Геном рггр:» пр;гз (однонитеаая РНК) %Ю(:"Ф!!~,,':~::ущ;-,;,".'!,'~,"':,",,".':;:,";.'рлу;,':::::.,";;:;:„' -;:;";,'ежн!-,'~з!:!::!')1(йФ' Обратная трацекринтаза преобразует РНК-геном а даухнитеаую ДНК.
ДНК ячн... „,з,ф~~, ° ""'.: л | Вирусные гены заменяютея чужеродным генам. Рекомбинантпая ааруч гещп ДНК рш~ю»пру~.. :Ъй!В!»",: !,---.,'„':.Г.«В": | Рекомбинантная ДНК проникает а клетки тканеаой культуры. В клетках,галер жащих аепомогательный пиру«, образуются РНК- копии рекпмбинантных вирусов, .
фе', ! упакоаыаающиеея затем а аируепых частицах. г)йг,й» ш гранскрн птаза и интеграаа Ретрааируеный РНК-генам е чужеродным геном Рекпмбинантные вирусные частицы инфицируют клетку-мишень. Геном регроаируса с чужеродным генам астраиааетея а хромосому клетки-мишени. концах (1.ТК-последовательности, от англ. 1опд геппгпаг терегп эедиепсеэ) для встраивания ретро- вирусной ДНК в хромосому хозяина и тр (пси)- последовательность для упаковки вирусной ДНК в вирусных частицах (см. рис. 26-34).
Гены дай, ра1 и епп генома ретровируса, необходимые для его репликации и образования вирус- Рис. 9-32. Использование ретровирусных векторов в клонировании клеток млекопитающих. Типичный геном ретровируса (здесь приведен а несколько упрощенном виде), сконструированный так, чтобы нести чужеродный геи (окрашен в розовый цвет), добавляется а тканеауа культуру нлеток-хозяеа. У вспомогательного вируса (здесь не показан) отсутствует упаковочная последовательность, ~р, так что его РНК-траиснрипты ие могут упаковаться в вирусные частицы, но зато он предоставляет продукты генов дад, ро) и епк необходимые для упаковки сконструированного ретровируса в функциональные вирусные частицы. Это дает вазможность чужеродному гену, находящемуся в геноме рекомбинантиого ретроанруса, эффективно встроиться а клетки-мишени.
ных частиц, можно заменить чужеродной ДНК. Для образования вирусов с рекомбинантнай генетической информацией необходимо ввести ДНК в культивированные клетки, инфицированные «вспомогательным вирусом», несущим гены для образования вирусных частиц, на не имеющим зр-последовательности, необходимой для упаковки. Таким образом удается трапскрибировать ДНК и упаковывать ее РНК в вирусные частицы.
Эти частицы могут действовать как векторы для введения рекомбинантной РН К в клетки-мишани. Вирусные ферменты обратная транскриптаза и интеграза (образующиеся с помощью вспомогательного вируса) тоже упаковываются в вирусную частицу и попадают в клетки-лгишени. Как талька специально сконструированный вирусный геном оказывается внутри клетки, эти ферлгенты сазлают ДНК-капию рскамбипантнога вирусного РНК-генома и встраивают ес в хромосому хозяина.
После этого встроенная рекамбицантная ДНК становится пасгояшюй частью хромосомы клетки-мишени и реплицируется вместе с ней при каждом делении клетки. Сами по себе клетки пе подвергаются опасности при встраивании вирусной ДНК, поскольку реколгбинантный вирус не содержит генов, необходимых для создания РНК-копий своега генома и упаковки их в новые вирусные частицы.
Применение рекомбинантных ретровирусов зачастую являстся наилучшим способом введения ДНК в значительное число клеток млекопитающих. Для вирусов каждого вида характерны свои особенности, поэтому при разработке векторов для трансформации клеток млекопитающих испальзукгг различные классы вирусов живот- 9.4 Изменения генона и новые продукты биотехнологии 14751 Как только биотехнология получила сильный толчок в 1980-х гг., стала весьма заманчивой илея профилактики генетических заболеваний. В принципе,в клетки человека можно ввести ДНК для корректировки наследственных генетических нарушений. Генетическую коррекцию можно даже осуществить на уровне отдельной ткани, заразив человека генетически сконструированным, тканеспецифичпым вирусом, несущим в качестве полезного груза ДНК, которую нужно ввести в дефектные клетки.
Такая задача выглядит чарующе, но на пути исследований полно преград. Изменение хромосомной ДНК влечет за собой существенный риск — риск, который нельзя оценить на ранних стадиях открытия. В связи с этим первые попытки генной терапии человека были направлены всего лишь на небольшое число генетических заболеваний. Ученые и борцы за нравственность вместе разработали список из нескольких условий, которые должны быть соблюдены для оправдания сопутствующего риска. (1) Генетический дефект должен являться хорошо изученным нарушением в единственном гене. (2) И мутантный, и нормальный гены должны быть клонировапы и ссквспированы.
(3) При отсутствии способа устранения существукнцего мутантного гена функциональный ген должен хорошо работать в присутствии мутантного. (4) Наконец, что ваиболсс важно, серьезность заболевания лолжна перевешивать риски, свойственные новой технологии. Соглашения по клиническим испытаниям на человеке были представлены учеными из нескольких стран я критически рассмотрены па предмет соответствия нормам этики и соблюдения научной строгости тщательно подобранными консультативными группами в каждой стране; только после этого испытания на человеке начались. С самого начала ~синая терапия была нацелена на раковые и генетические заболевания, оказывающие воздействие на иммунную систему.
Иммунитет контролируется лейкоцитами (белыми клетками крови) нескольких типов, берущих свое начало из недифференцированных стволовых клеток костного хозга. Эти клетки быстро делятся и обладают некоторыми метаболическими особенностями. По нескольхяи причинам дифференцировка может остановиться, приводя к состоянию под названием тяжелый комбинированный иммунодефицит (ЯС1Р, от англ. тщете сотЬ(пег> 1тпшпе гге~тепсу). Одна из форм БСГР возникает из-за наследственных генетических нарушений в гене, кодирующем аденозннлезаминазу (АРА, от англ.
а>1епоз>пе гаев>п>пахе), фермент, участвующий в биосинтсзс нуклсотидов (обсуждается в гл. 22). Другая форма БС1Р возникает из-за дефекта в белке рецептора клеточной поверхности, связывающего сигнальные молекулы цитокины, запускающие дифференцировку. В об>оих случаях ств<>ловыс клетки-предшественники не могут дифференцироваться в готовые клетки иммунной системы, такие как Т- и В-лимфоциты (см. с. 249).
Дети с такими редкими заболеваниями чрезвычайно восприимчивы к бактериальным и вирусным инфекциям и очень часто страдают от целого ряда связанных с этим физиологических и неврологических проблем. В отсутствие эффективной терапии дети должны содержаться в стерильной обстановке. Примерно у 20% таких детей есть брат или сестра с идентичным антигсном лейкоцитов человека (Н).А, от англ. Йиглап 1еийосуге апггйеп), который может служить донором при пересадке костного мозга. Для остальных детей нужны другис подходы. Самая первая попытка генной терапии человека была осуществлена в Национальном институте здоровья в Бетесде, шт. Мэриленд, в 1990» Пациентом была четырехлетняя девочка, страдающая АРА- дефицитом. Клетки костного моз~а ребенка трансформировали специально созданным ретровирусом, несущим функциональный АРА-гец„когда изменение клеток происходит таким образом — правда, в лаборатории, а не на живом пациенте, — п>варят, что процелура осуществлена ех глоо.
Обработанные клетки вводили обратно в костный мозг пациента. Через 4 года ребенок вел уже нормальнук> жиань, ходил в школу и Лаже торжественно заявлял о своих переживаниях перел Конгрессом. Тем не менее восстановление девочки нельзя целиком приписать генной терапии. Перед началом клинических испытаний метода генной терапии исследователи разработали новый метод лечения недостатка АРА, в котором синтетическая аденозиндезаминаза вводилась в комплексе с полиэтиленгликолем (РЕС, от англ. Ро1уегйу1епе К1усо1). Для многих пациентов с АРА-ЯС1Р введение комплекса АРА-РЕС позволяет начать развитие иммунной системы наряду с увеличением массы тела и понижением частоты инфекционных заболеваний, хотя и не приводит к полному ее восстановлению.
[476) Часть 1. 9. Технологии на основе информации изДНК Успешность нои)й генной терапии пе была очевидна, поэтому отказываться от практики введения фермента в ниле кочплекса с РЕС при проведении гснпотсрапевтического испытания было неэтично. Таким образом, участники испытаний получали сразу оба метола лечения, и было непонятно, какой из них в первую очерель стоит за положительными клиническими результатами. Тем нс менее клиническое испытание предоставило ценную информацию: перелача генов ех гдгю болыпому числу лейкоцитов осуществима, причем клетки с перенесенным геном все еще наблюдалнсь и через несколько лет после лечения, что означает возможность долговременной коррекции. Кроме того, риск, связанный с использованием ретро- вирусных векторов, оценивается как невысокий.
В течение 1990-х гг. были выполнены сотни кли- ничсских попыток генной терапии многих генетических заболеваний человека, но в болыпинстве случаев результаты были обескураживающими. Выяснилось, что главным препятствием было неэффективное введение новых генов в клетки. Трансформация многих клеток просто це удавалась, а число трансформированных клеток часто оказывалось недостаточнылг для исправления генетического нарушения. В жспериментах с АРА было чрезвычайно трудно получить достаточнух~ популяцию трансформированных клеток из-за ведущейся в то же время АРА-РЕС-терапии. Обычно стволовыс клетки с правильным АРА-геном имеют преимущество в росте пад необраГнпанными клетками, расширяя свох> популяцию и постепенно преобладая в костном мозге. Однако введение комплекса АРА-РЕС тем жс пациентам позволяло нстрансформированным (с дефицитом АРА) клеткам жить и развиваться, а у трансформированных клеток уже пе было гого необходимого преимущества в росте, чтобы расширить свою популяцию за счет других.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
