Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 157
Текст из файла (страница 157)
НзЫ'-А!а — Рго — Ме1 — ТЬг — Тгр — Туг — Суз — Мес— Аяр — Тгр — 1!е — А1а — Иу — С!у — Рго — Тгр — РЬе — Агй— 1.уз-Аэп-ТЬг — 1.уя— 5. Создание диагностических тестов генетических заболеваний. Болезнь Хантингтона (БХ) является наследственным нейродегенеративным нарушением, характеризующимся постепенным, необратимым ухудшением психических, двигательных и умственных способностей. Симптомы обычно появляются в среднем возрасте, тем не меяее приступ болезни может начаться практиче- ски в любом возрасте. Болезнь может длиться от 15 до 20 лет. Сейчас молекулярная основа заболевания становится более понятной.
Генетическая мутация, лежащая в основе БХ, была обнаружена в гене, кодируюшем белок (М„= 350 000) с неизвестной функцией. У лн>дей, не страдаюших БХ, участок гена, кодирующий Ы-конец белка, состоит из гюследовательностей кодонов САС (соответствует глутамину), повторяющихся от 6 до 39 раз подряд. У людей с синдромом БХ в зрелом возрасте этот кодов, как правило, повторяется от 40 до 55 раз, а у людей, страдающих БХ с детства, более 70 раз. На основании длины этого простого трехнуклеотидного повтора можно сказать, разовьется ли у человека БХ, и примерно в каком возрасте появятся первые симптомы.
Внизу показана неболыпая часть Ы-концевой кодирующей последовательности гена БХ, сопоящего из 3143 кодонов. Нуклеотидная последовательность ДНК выделена черным цветом, аминокислотная последовательность, соответствующая гену, показана синим цветом„а САС-повтор затенен. Используя рис. 27-7 для трансляции генетического кода, опишите в общих чертах тест на БХ па основе ПЦР который можно было бы осуществить в образце крови. Примите, что праймер для ПЦР должен иметь длину 25 нуклеотидов. По традиции, если не оговаривается иначе, последовательность ДНК, кодирующая белок, изображается кодируюшей цепочкой (последовательность, идентичши мРНК, которая транскрибируется из гена) сверху так чтобы она чнгышсь от 50-юнца к 3'-концу слева направо. 007 АТОССОАСССТССААААССТСАТСААССССГГСОАОТСССТСААОТССГГС 1 м А т ь е к 1. м к А Р в 0 1. к а Р ам сьосьоттссьссьссьосьссьссьосьссьосьосьссьссьосьссьо зьч С Р 409 САССАССАССАССАССМЗСАССААСАССССССАСССССССССССССССССО ЗА С С С С С С С С С Р Р Р Р Р Р Р Р МС СССССтССтСАССТГССТСАСССОСССССо ы Р Р Р и ь Р С Р Р Источник: ТЬС Нсвцсдтоп'ь 01аеаяе СойаЬогацче ВеяеагеЬ Сговр.
(1993) А соте! депе совгав йода гг1ввс!ео0010 Терезе ГЬат 1я ехрас0!ед асд ссяГАЫе ос Н спйсдеоп'а с!1аеазе СЬгосзоао0000. Сей 72, 97! — 983. 6. Использование ПЦР для обнаружения кольцевых молекул ДНК. У реснитчатых одноклеточных организмов иногда удаляется сегмент геномпой ДНК Удаление является генетически запрограммированной реакцией, связанной со скрешиванисм П рея кол агаемая реакция Совналааинис клоны 1 Девять фрагментов рестрикции [484] Часть 1.
9. Технологии на основе информации из дНК клеток. Ученые предполагают, что ДНК удаляется в процессе сайт-специфичной рекомбинации, ДНК на обоих концах сегмента, которые скрепляются вместе, а улаленная ДНК появляется в виде кольцевой молекулы в качестве про.~лста реакции. Подумайте„как можно использовать полимераз- ную цепную реакцию (ПЦР) для обнаружения циклической формы удаленной ДНК в экстракте одноклеточных организмов. 7. Светящиеся растения.
Выращенные на обычной садовой почве в условиях нормального полива растения, несущие ген зеленого флуоресцентного белка (см. рис. 9-15, а), светятся в темноте, а растения, несущие ген люциферазы светляка (см. рис. 9-29), не светятся. Как можно это объяснить? 8. Использование КН.Р-анализа для теста на отцовство. Получение отпечатков ДНК и КР1.Р- анализ очень часто используют при тест.е па отцовство. Ребенок наследует хромосомы как от матери, так и от отца, поэтому в ДНК ребенка обнаруживаются отдельные рестрикпионныс фрагменты генетического материала, взятые у каждого из родитслсй.
На основе данных электрофореза, приведенных здесь, скажите, какой ребенок, сели таковой имеется, не является биологическим потомком предполагаемого отца? Обоснуйте свой вывод. Дорожка М соответствует пробе, взятой у матери, Р— у предполагаемого отца, а Сн Ст и Сз — у детей.
9. Картирование хромосомного сегмента. Группа перекрывающихся клонов, обозначенных буквами от А до Р, получена из одного н того же участка хромосомы. Каждый из клонов по отдельности разрезается рестриктазой, а фрагменты разделяются электрофорезом в агарозном геле, как это показано на рисунке снизу. Из этого участка хромосомы рестрикцией получено девять различных фрагментов, причем в каждом клоне есть их определенное подмножество.
На основе этой информации определите порядок следования рестрикционных фрагментов в хромосоме. 10. Клонирование в растениях. В методике, схематично изображенной иа рис. 9-28, использутотся клетки бактерии р. Айгобас1елит, содержащие две отдельные плазмиды. Подумайте, почему последовательности двух плазмид нс объединяются в одну. 11. Получение отпечатков ДНК и КИ.Р- анализ. Из клеток крови двух различных людей (1 и 2) берут ДНК. В отдельных экспериментах ДНК каждо~о из них разрезают эндонуклеазами рестрикции А, В и С, а фрагменты разделяют электрофорезом.
На рисунке изображена гипотетическая карта сегмента хромосомы человека длиной 10 000 и. н. У 2-го человека есть точечные мутации, устраняющие рестрикционные сайты распознавания В' и С'. Вы метите гель радиоактивным олигонуклеотидом, комплементарным указанной последовательности, и подносите к гелю рентгеновскую пленку. Укажите, где бы на пленке вы ожидали увидеть полосы. Дорожки и геле отмечены на сопутствующей диаграмме. А В Сон. ВС ВА С 1с — ' з11 1 ! 1. ~ з ь .з 3 т.п.н.О 1 2 3 4 6 6 7 8 9 10 А В С М ~1 21 ~1 2З ~1 2" 10 9 8 7 6 6 4 М 1 2~ 1 2~ 1 21 А В С 12.
Использование фотолитографии в приготовлении ДНК-микрочипов. На рис. 9-21 показаны начальные этапы в процессе приготовления ДНК-микрочипа или ДНК-чипа с использованием фотолитографии. Опишите остальные этапы, необходимые для получения требуемых последовательностей (разная четы рехнуклеотидная последовательность и каждой из четырех ячеек), изображенных на рисунке на первой иллюстрапии в рамке. После каждого шага покажите получившуюся нуклеотидную последовательность, прикрепленную к каждой ячейке. 13.
Клонирование в млекопитающих. Ретро- вирусные векторы, приведенные на рис. 9-32, позволяют осуществить эффективную ннтеграпию привнесенной ДНК в геном млекопитающего. Объясните, как эти векторы, у которых нет генов репликации и упаковки вируса (яая, ро!, епп), помещаются в инфицирующие вирусные частицы. Подумайте, почему так важно, чтобы у этих векторов не было генов репликапии и упаковки. Анализ зхспериментальных данных 1485) Анализ экспериментальных данных 14.
НтсП: Первая эндонуклеаза рестрикции. Об открытии зндонуклеазы рестрикции, которую можно было использовать на практике, впервые сообщалось в двух статьях, опубликованных в 1970 г. В первой работе Смит и Унлкокс описали выделение фермента, который расщеплял двуннтевую ДНК. Нуклсазную активность фермента измеряли по снижению вязкости растиора ДНК при его обработке ферментом. а) Почему вязкость раствора ДНК уменьшается после обработки ферментом? Для того чтобы понять, является ли фермент андо- или экзонуклеазой, им обрабатывали ДНК, меченную ззр а затем добавляли трихлоруксусную кислоту (ТХУ).
В таких условиях единичные нуклеотиды должны были оставаться в растворе, а олигонуклеотиды должны были выпадать в осадок. б) При обработке меченой ДНК ферментом не образовывалось фрагментов, растворимых в ТХУ. На основании этого результата устаноните, являлся ли фермент андо- или экзонуклеазой. Объясните свои рассуждения. При расщеплении полннуклеотидпой цени фосфатная группа обычно не отщепляется, а остается связашюй с 5'- или 3"-копцом образующегося фрагмента ДНК. Смит и Уилкокс предложили следующий протокол дзи определения положения фосфатной группы. 1. Обработка немеченной ДНК-нуклсазой. 2. Добавление к аликвоте продукта, полученного на стадии 1,меченного радиоактииной меткой АТР (т-~ззр1АТР), и полинуклеотидкиназы (фермент, который присоединяет т-фосфат АТР к 5'-гидроксильной группе, но не к 5'-фосфатпой, 3'-гндроксильной или 3'-фосфатной группе).
Измерение количества ззр, включенного в ДНК (образец А). 3. Добавление к продукту, полученному на стадии 1, щелочной фосфатазы (фермент, удаляющий фосфатные группы с 5'- и 3'-концов), а затем полинуклеотидкиназы и т-~ззр)АТР Измерение количества ззр включенного в ДНК (образец В). ~4861 Часть 1. 9. Технологии на основе информации ик ДНК в) Оказалось, что образец А обладал радиоактивностью 136 имп./мин, а образец В— 3740 им>ь/мин. Зная это, ответьте, оставалась ли фосфатная группа на 5'- или на 3'-конце фрагмента ДНК после обработки ферментом7 Объясните свой ответ.
г) При обработке ДНК бактериофага Т7 нукпеазой появлялось около 40 фрагментов ДНК различной длины. Каким образом этот факт свидетельствует в пользу того, что фермент рестрикции узнает специфические участки ДНК, а не вносит в двойную спираль случайные разрывы? На данном этапе исследования существовало две гипотезы: 1) фермент вносит разрывы внутри узнаваемого им участка; 2) фермент узнает определенную последовательность, но расщепляет ДНК где-то на соседнем участке.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
