Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 152
Текст из файла (страница 152)
Эта проблема была решена при помоцги почвенной бактерии АдгоЬасгепит гите~ас(еле. Эта бактерия способна поражать растения в месте повреждения, трансформировать соседние клетки и вызывать образование опухоли под названисм корончатый галл. Клетка АдгоЬасгепит содержит огромную (200000 и.
и.) Тз-плазмиду (рис. 9-26, а). При контакте бактерии с поврежденной клеткой растения 23000 и. н. сегмента Тг-плазмиды под названием Т-ДНК переносятся из плазмнлы и встраиваются в произвольном месте одной из хролюсом клетки растения (рис. 9-26, б). Перенос Т-ДНК из АлгоЬасгепит в хромосому растительной клетки зависит от повторов длиной в 25 п. н. на концах Т-ДНК и от продуктов генов вирулентности (гбг) в Тг-плазмиде (рис.
9-26, а). Т-ДНК кодирует ферменты, которые преобразуют растительные мстаболиты в два класса соединений, выгодных бактерии (рис. 9-27). Во-первых, зто гормоны роста растения (ауксины и цитоки нины), стимулирующих рост трансформированных растительных клеток с образованием опухоли — корончатого галла. Во-вторых, зто ряд редких аминокислот, названных онинами, которые служат в качестве источника питания для бактерии.
В клетках опухоли оцины образуготся в больших количествах и секретируются в окружающую среду, где усвоить их может только АроЬасгеНит, используя ферменты, кодирусмые в Тг-плазмиде. Такилг образом, бактерия псренацравляет ресурсы растения, преобразуя их в форму, которая устраивает только ее саму. Этот необыкновенный пример передачи ДНК из прокариотической клетки в эукариотичсскую — природный генно-ннжснсрный процесс, который исследователи могут использовать для передачи рекомбинантной ДНК (вместо Т-ДНК) гсному растения.
В распространенной методике клонирования используют колонии бактерии р. АдгоЬасгет)ит с двумя разными рекомбинантпыми плазмидами. Первая — зто Тг-плазмида, у которой искусственно удален сегмент Т-ДНК 9.4 Изменения генома н новые продукты биотехнологии (471) (рис. 9-28, а). Вторая — шаттл-вектор АлгоЬас~епит-Е. согг', у которого повторы Т-ДНК в 25 п. и. фланкиру>от чужеродный ген, который нужно по- Клетка Лрибассепигл Т>-плазмнда беа Т-ЛНК б Рекомбпнантпан плазмнда с чужеродным геном н геном устойчнаостн к кана мпппну, расположенными межлу двумя 25 парнымп Т-Д Н К понто рамн += — 25 парные понзоры Фактор усгойчппостп к капамнпнну Чужеродный геп Бактерия попадает и место повреждения (гле лист разрезаетсн). Фрагменты листка >Рг помешаютсн а чашку с агаром.
4у~ ч~д Лгароаан чашка с гормопамн нйа роста н канамппнном Растепин регеперпруютсн нл фрагментов листка. Этн капамнцнн-устойчппые растения содержат чужеродный ген. Ркс. 9-28. Двухплазмндный метод создания рекомбнааатных растений. и) Одна нз плазмкд — зто моднфнцнроаанная Тзплазмнда, которая содержит иг-гены, но не Т-ДНК. 6) Другая плазмнда содержит сегмент ДНК несущкй как чужеродный ген (ннтересую>ций ген, например, кнсектнцндного белка, изображенного на рнс.
9-30), так к фактор устойчивости к антибиотику (в данном случае к канамнцнну), который фланкнруется двумя Т-ДНК повторена а 25 и. н., необходнмымк для передачи плазмндных генов хромосоме растения. В плазмнде также прнсутсгзует покус начала репликацнн (оп), необходимый для рззмноження бактерии р. Адгобпсгег>ит. местить в растительную клетку, вместе с селектируемым маркером, например геном устойчивости к антибиотику канамицину (рис. 9-28, б). Сконструированная таким образом культура АлгоЬас~егтит используется лля инфицирования листа растения, но корончатые галлы не образуются из-за того, что из обеих плазмид удалены Т-ДИК гены ферментов биосинтеза ауксинов, цитокининов и опинов. Вместо этого продукты гбг-гена из измененной Т>-плазмиды направляют трансформацию растительных клеток чужеродным геном, который фланкируется Т-ДНК повторами в 25 и.
н. во второй плазмице. Трансфорлгированпые клетки растений можно отобрать при выращивании на чашках с агаром, содержащих канамицин, а добавление гормонов роста ускорит образование новых растений с чужеродным геном в каждой клетке. Когда бактерия попадает в место повреждения (на границу разрезанного листа), г>гг-гены первой плазмиды опосредуют передачу геному растения сегмента второй плазмиды, ко~орый фланкируется повторами в 25 п. н. с)>рагменты листа помещают на чашку с агаром, содержащую и капамицин, и соответствующие количества гормонов роста растения; таким образом из фрагментов с трансформированными клетками формируются новые растения. Нетрансформиропанные клетки уничтожах>тся канамицином.
Чужеродный ген и фактор устойчивости к антибиотику обычно передаются вмссте, так что клетки растения, которые растут н такой среде, как правило, содержат интересующий ген. Успп>ггньгй перенос рекомбипаптной ДНК растениям был отчетливо продемонстрирован в эксперименте по встраиванию гена люцифсразы светляка в клетки табака (рис. 9-29) — наиболее удобного растения для экспериментов по трансформации, так как его клетки чрезвычайно легко трансформировать клетками АлгоЬасгепилл Безусловно, возможности этой технологии не ограничиваются созданием светящихся в тел>ноте растений. Такой же метод использовался для создания сельскохозяйственных культур, устойчивых к гербицидам, растительным вирусам и насекомым-вредителям (рис.
9-30). Возлюжная выгода заключается в повышении урожайности н снижении необходимости применения вредных лля окружающей срелы сельскохозяйственных химикатов. О 3 ! О 1лифос»з (372) Часть|. 9. Технологии на основеикформации изДНК Рис. 9-29. Растение табака, экспрессирующее ген люциферазы светляка. Свечение возникало после полива растения раствором люциферина, субстратом фермента люциферазы, вызывающего биолюминесценцию (см. доп. 13-1). Однако светящихся в темноте декоративных растений в наших рассадниках ожидать в скором времени не приходится. В действительности испускаемый свет довольно слаб; для получения приведенной фотографии потребовалась 24-часовая экспозиция.
Однако таким образом демонстрируется истинное значение этой технологии, заключающееся в возможности передачи растениям новых свойств. Рис. 9-30. Томаты, устойчивые к личинкам насекомых. Два растения томата подвергались воздействию одинакового числа личинок мотылька. Растение слева не было генетически измененным. В растении справа зкспрессируется ген белка токсина из бактерии ВасИиз СИиг(пд(елмаз.
Этот белок, встроенный по схеме, приведенной на рис. 9-28„ токсичен для личинок некоторых видов бабочек и безопасен для людей и других организмов. Устойчивость к насекомым была также генетически создана у хлопка и у других растений. Рис. 9-31. Устойчивые к глифосату побеги сои. Два участка соевого поля в шт. Висконсин, США. а) Часть поля, не обработанная глифосатом, заросла сорняками. б) Устойчивые к глифосату соевые побеги бурно растут на обработанной этим гербицидом области поля. В окружающей среде глифосат быстро распадается. Использование в сельском хозяйстве генетически модифицированных растений, подобных этим, произойдет только после тщательного рассмотрения всех «за» и «против», уравновешивая исключительные перспективы новой технологии с необходимостью осмотрительного выбора новых свойств.
И наукд и общество в целом заинтересованы в том, чтобы использование генетически модифицированных растений не оказало неблагоприятного воздействия на окружающую среду или здоровье человека. 9.4 Изменения генома и новые продукты биотехнологии 1473] Биотехнология позволяет придавать растениям новые свойства намного быстрее традиционных методов селекции. Ярким примером является разведенис сои, устойчивой к распростра~геннозиу гербициду глифосату (активному ингредиенту в пролукте КоппЖр). Глифосат быстро распадается в окружающей среде (чувствительные к глифосату растения можно сеять на обработанной территории уже через 48 ч), и его применение обычно не приводит к загрязнению груггговых вод или к сохранению остатков до следующего года.
Поля с устойчивой к глифосату соей можно один раз обработать этим гербицидом но время летнего посевного периода для уничтожения практически всех сорняков на поле, не воздействуя при атом на саму сок> (рис. 9-31). Однако возможные «подводные камни» технологии, напригиер появление устойчивых к глифосату сорняков или одичание трудноконтролируемых рекомбинантных растений, вызывают беспокойство ученых и обществснности. Манипулирование с геномами клеток животных дает информацию о структуре хромосом и экспрессии генов Трансформация клеток животных чужеродным генетическим материалом предоставляет нс только возможность расширения наших знаний о структуре и работе их геномов, но и важный способ выведсния пород животных с новыми качествами.
Такая перспектива стимулировала интенсивные исследования более совершенных методов клонирования животных. Для большинства работ такого рода требуется источник клеток„в которые можно встроить ДНК Несмотря на то что интактные ткани зачастую трудно сохранять и работать с ними т глуш, многие типы клеток животных можно выделить и вырастить в лабораторных условиях в том случае, если трсГювания для их роста тщательно выполняются. Клетки, полученные из определенной ткани животного и выращиваемые в соответпнующих для культуры ткани условиях, могут сохранять дифференцировку (например, гепатоциты (клетки печени) остаются гепатоцитагии) в течение недель или даже месяцев.
Для введения ДНК в клетки животных не найдено подходящего вектора, подобного плазиидам, поэтому для трансформации, как пра- вило, требуется встраивание ДНК в хромосому клетки-хозяина. Эффективная доставка ДНК до клеточного ядра и встраивание этой ДНК в хромосому без повреждения каких бы то ни было важных генов остаются основной технической проблемой в генной инженерии клеток животных. РазраГютанные мстоды переноса ДНК н клетку животного различаются цо своей эффективности и удобству. Некоторый успех был достигнут в спонтанном введении ДНК или электропорации (зти методы отдаленно напоминают распространенные методы трансформации бактерий).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
