Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 151
Текст из файла (страница 151)
Дрожжевая двугибридиая система. Усовершеп- ствованныйгенетическийметодопределениябелокбелковых пзаилзодействий основан на свойствах белка Са14 (Са!4р), активирующего транскрипцию определенных генов дрожжей (см. Рис. 28-31). У белка Са!4р есть два домена, один из которых связывается со специфической последовательностью ДНК, а другой активирует РНК-полимеразу, синтезирующую мРНК из соседнего репортерного гена. По отдельности каждый из доменов стабилен, по для активации РНК-полимеразы необходимо взаимодействие с акгивационным ломепом, которому в свою очередь нужно позиционирование ДНК-связывающим ломеном. Таким образом, чтобы домены работали правильно, они должны быть расположены рядом (рис. 9-25, а).
В этом методе колирующие белок участки изучаемых генов сливаются с копирующими последовательностями либо ДНК-связывающего домена, либо активационного домена белка Са!4р, и получившиеся гены экспрессируют ряд слитых белков.
Если белок, пришитый к ДНК-связывахтщему домену, взаимодействует с белком, пришитым к активационному домену, то начинается транскрипция. Репортерпый ген, транскрибируемый при такой активации, как правило, кодирует белок, необходимый для клеточного роста, нли фермент, катализирующий реакцию с окрашенным продуктом. Таким образом, при росте в подходящей среде клетки, которые содержат такую пару взаитаодействукшгих белков, можно легко отличить от тех, которые ее не имеют. В болыпинстве случаев ген ДНК-связывающего домена Са!4р сливается со множеством генов в одном штамме дрожжей, а ген активационного домена Са!4р сливается со многими другими генами во втором штатаме, затем штаммы дрожжей конъюгируют и выращивают колонии из отдель- дрожжевой штамм ! со сшивквми Сз!4р-связывающего ломепв дрожжевой штамм 2 со сшивками Са!4р-акгиизниопиаго домена ЛНК-связывающий домел Св!4р ф пяогзция с образованием идиых клеток.
Репортерпый геи . Актива ионный Участок связывания Са!4р зеиие в среду, для взиия клетки в которой тся взаимодействие взюшего и пиоипого домеиов. домел Св14р РНК- полимераза Образование колоний выживших клеток. Репортериый геи Секвеиироваиие слитых белков для обнаружения вззимодействуюших белков.
Рис. 9-29. Дрожжевая двугибридная система. а) В этой системе для определения белок- белковых взаимодействий происходит соединение ДНК-связывающего и активациониого доменов белка ба!4 дрожжей благодаря взаимодействию двух белков Х и т, к которым присоединен каждый из доменов. Взаимодействие вызывает экспрессию репортериого гена.
б) у разных штаммов дрожжей, которые затем подвергаются хоиъюгации, создаются две сшивки. Коиъюгироваииый раствор помещаетсп в среду, в которой дрожжи ие могут выжить, если у них ие экспрессируется репортериый геи. Таким образом, у всех выживших колоний епъ взаимодействующие пары слитых друг с другом белков. Секвеин ров а и не связанных белков у выжи вших клеток выявляет взаимодействующие белки.
а) дронокевые двугибридные системы Краткое содержание раздела 9.3 ОТ ГЕНОМОВ К ПРОТЕОМАМ [468! Часть 1. 9. Технологии на основе информации из ДНК ных диплоидных клеток (рнс. 9-25, б). Это позволяет осуществлять широкомасштабный скрининг взаилзодействук>щих в клетке белков. Все этн метолы дают важные сведения о функции белка. Тем не менее они не исключают подходов классической биохимии. Опи просто предоставляют исследователю свободный доступ ко многим новым важным биологическим проблемам. Наконец, для полного понимания функциональной роли любого нового белка необходимы традиционные биохимические методы, которые, например, использовались для идентификации многих хорошо изученных белков.
В совокупности с постоянно развивающимися методами биохимии и лзолекулярной биологии геномика и протеомнка ускоряет открытие не только новых белков, но и еще не известных биологических процессов и механизмов. ° Протеом — совокупность белков, экспрессируемых геномом клетки. Новая область протеомики осуществляет попытку составления каталога и определения функций всех белков в клетке. Интегральный подход к анализу множества белков нли других макромолекул в клетке иногда называют системной биологией.
° Один из наиболее эффективных способов выяснения функции нового гена осуществляется методами сравнительной гецомнкн, т. е. поиском в базах данных генов с одинаковыми последовательностями. Парааоги и ортолоП1 — это белки (и нх гены) с явными сходствамн последовательностей и функций в одном и 94 Изиеиеиия генома и новые продукты биотехнологии (469) разных видах соответственно. В некоторых случаях присутствие гена н комбинации с определенными другими генами, наблюдаемое э виде паттерна в нескольких гсномах, может указать на эозлюжную функцию. ° Клеточные протсомы можно наблюдать двумерным гсль-электрофорсзом и изучать с поногцью масс-сцсктрометрии. ° Функцию белка в клетке иногда можно предположить, выяснив, когда и где его гон экспрессируетсю Ученые используют ДНК-микрочипы (чицы) и бслковыс чипы для изучения экспрессии гена на клеточном уровне. ° С полюгцьк> некоторых новых лгетодик, включая сравнительную геномнку, иммунопрсцицитацию и дрожжевые двугибридные системы, можно регистрировать белок-белковые взаимодействия.
Такис взаимодействия дают важныс сведения о функции белка. 9.4. Изменения генома и новые продукты биотехнологии Не надо заглядывать в далекое будушес, чтобы найти практические примснсния новых биотсхнологнй аяи увидеть перспективы новых открытий в фундаментальной науке. Геполгика сама подаст идеи и осрстся за их осуществление.
Мы не только можем понлтпь строение геномов, мы можсм их измеиять. Пожалуй, эта возможность является наивысшим достижением современных технологий. Мы расширим наши возможности управления организмами и пазучсння новых фармацсвтнчсских агентов и, следовательно, улучшим питание и здоровье человека. Танис перспективы можно осуществить только в тон случае, если на практике будут соблюдаться нсры предосторожности во избежание бсзотвегстзенного применения новых технологий. бактериальные паразиты растений способствуют клонированию в растениях Введение рскомбинанпюй ДН К в растения нмсст огромное значение для сельского хозяйства, позволяя изменять питательные характеристики н урожаи культур или их устойчивость к воздсйст- виям окружаюшей среды, например насекомым- вредителям, заболеваниям, холоду, засоленности почв и засухе. Взрослые растения некоторых видов можно создать из единственной трансформи- Ыг" ге и ы 25 парные повторы у Тмплааммла Т-ДНК Поврежденная клетка Растсвия образует ацетосиРицгогс з",Я~~~:-',...
Клетка ),--" Растительная клетка синтезирует ауксицы, Ацетосирингоп ' цвтокиникы опицы. .'+„активирует иогецы. образуется опухоль. ",,",'4:, Копия Т-ДПК церецосится и встраивается в ол хромосому б клетки Рис. 9-26. Перенос ДНК растительным клеткам с помощью бактерии-паразита. а) Тг-плазмида (от англ. палат 1пг(истпд) АртоЬасгетштп Гитпе~апепз. б) Поврежденные растительные клетки образуют и высвобождают фекальное соединение ацетосирингон. При обнаружении этого соединения у р. АдтоЬасгелит начинается знспрессия генов вирулентности (Ит) Тчплазмиды. Эти ит-гены кодируют ферменты, необходимые для встраивания сегмента Т-ДНК Тчплазмиды а геном соседних растительных клеток. Образуется одноцепочечная копия Т-ДНК которая переносится в растительную клетку, где превращается в двуцепочечную ДНК и встраивается а ее хромосому.
Т-ДНК нодирует ферменты, синтезирующие нан гормоны роста растения, тан и олины (рис. 9-27). Последние соединения усваиваются (в начестве источнина питания) только бактериями р. АдтоЬасгетгипг. Таким образом, экспрессия генов Т-ДНК в трансформированных растительных клетнах приводит как к аберрантному расту клеток растения (образование опухоли), тан и к передаче бактерии питательных веществ растительной клетки.
Рнс. 9-27. Ивзаболнты, образующиеся в растительных клетках, инфицированных бактерией р.лргойасгвгтит. Аукснны н цнтокинмны — гормоны роста растения. Наиболее распространенный аукснн, индолилацетат, синтезируется нз трнпгофана. Цнгокмннны являются про взводными аденк на. О пины обычно образуются мэ предшественников аминокислот ферментамимк, коднруемымм В-плазммдамн разных видов р. АдгоЬастепит, создается, по крайней мере, 14 различных опннов. 14701 Чапь1. з. Технологии на основе информации нз ДНК рованной клетки, так чтобы введенный ген переходил к потомкам в семенах. Ученые пока нс обнаружили встречающихся в природе плазмид растительных клеток, способствующих клонирования> в растениях, поэтому основная техническая проблема заключается во введении ДНК в растительные клетки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
