Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 142
Текст из файла (страница 142)
9. Технологии иа основе информации из ДНК Векторы на основе бактериофага А позволяют клопировать фрагменты ДНК длинс>й ло 23000 п. н. Как только фрагменты бактериофага )» лигированы с фрагментами чужеродной ДНК подходящего размера, получившиеся реколсбинантные ДНК могут быть упакованы в частицы фагов посредством добавления их к грубым экстрактам бактериальных клеток, которые содержат нсе необходимые белки для сборки целого фаза.
Этот процесс называется упаковкой (н п14го (рис. 9-5). Все жизнеспособные частицы фагов будут содержать фрагмент чужеродной ДНК. Дальнейший процесс переноса рекомбинантной ДНК в клетки Е. сой чрезвычайно эффективен. Искусственные бактериальные хромосомы (ВАС, от англ. Ьасгепа1 агЯ(па! сйготаютел). Искусственные бактериальные хромосомы представ.иют собой плазмилы, разработанные лля клонирования очень длинных (как правило, от 100 000 ло 300 000 и. н.) сегментов ДНК (рис. 9-6). Они обычно содержат селектируемые маркеры, такис как ген устойчивости к антибиотику хлорамфениколу (Сшн), а также очень стабильный покус начала рспликации (оп), поддерживающий число плазмид (1 — 2 копии на клетку).
В ВАС-векторы встраивают фрагменты ДНК из нескольких сотен тысяч пар оснований. Затем огромные колы!евые ДНК с помопп>ю электропореза помешают в бактерии-хозяева. В этих процедурах используют бактерии, содержащие мутации, которые изменяют структуру кчеточной стенки, что позволяет поглощать большие молекулы ДНК.
Искусственные хромосомы дрожжей (11АС, от англ. уеатг аггфаа! сйвтозотез). В генной инженерии клетки Е. сой вовсе не единственные кзеткихозяева Дрожжи — чрезвычайно удобные эукариотические организмы лля такой работы. Как и в случае с Е. сой, генетика дрожжей хорошо развита. Геном наиболее часто используемых дрожжей 5ассйаготусет сегеснз(ае содержит всего 14 10« п, н.
(по эукариотическим стандартам, это небольшой геном, менее чем в четыре раза превышает размер хромосомы Е. сой); вся его нуклеотилная последовательность известна. Дрожжи также очень легко содержать и выращивать в больших маспггабах в лабораторных условиях. Д.ш дрожжей были созданы плазмидные векторы, используя те же самые подходы, которые лежали в основе применения Селект руемын маркер ЕеоК1 Селектируемый маркер У Прн расщеплении с полсогсськ~ ВатН ! образуется линейная С- хромосома с тгвюмерными концами Егош ТЕь Х он СЕДг, У ТЕ1. -':> При расщеплении с помщнью ЕсоК! образуются лвв «рукава» ТЕ 1. Х ом СЕАг У ТЕЬ ::.:::!...........«:-'::; ..":::> Селектнруемый »е,л Селектируемый маркер маркер Х прннзл- !слфб У принвллежнт лежит левому ч( !«прввому «рукаву» «рукаву» Фрагменты геномной ДНК, образованные расщеплением Сщиввние с помощью ЕсоК! ФерменУАС твтивное Перенск расщепление клеточной 19! Ф ОтК рн ' ~Г~) Дрожжи с УАС-клоном Драно«сная клетка Дрожжевой сферопласт Рис.
9зД Конструирование искусственной хромосомы дрожжей (УАС). ТАС-вектор содержит локус начала ренлинации (оп), центромеру (СЕВ), две теломеры (ТЕС) и селектируемые марнеры (Хи У). Расщепление зндонуклеазами ВотН1 и ЕсоКТ создает два отдельных ДНК-«рукава»; наждый из них имеет один теломерный конец и один селектируемый марнер. Один большой сегмент ДНК (например, до 2 .
10» и. н. из генома человека) лигируется с двумя «Рукавами», образуя искусственную хромосому дрожжей. УАС трансформирует дрожжевые клетки (сферопласты с заранее удаленнымим клеточными стенками), и они селектируются по Х и У; уцелевшие клетки реплицируют ДНК-вставку. 9.1 КлонираваниеДНК:основные понятия 14431 рассмотренных выше векторов Е со!Е В настоящее время в распоряжении имеются удобпыс методы перепаса ДНК как из лрожжевых клеток, так и в них, что способствует изучению многих аспектов биохимии зукариотической клетки. Некоторые !х." камбинантные плазмиды содержат несколько оп и других элементов, что дает возможность использовать нх более чем для одного вида организмов (например, в клетках дрожжей или Е.
сод). Плазмиды, которые могут реплицироваться в клетках двух илн более различных видов, называются шазтлвекторамн. Исследования болыпих геномов и связанная с этим потребность в клонирующих векторах высокой емкости привели к созданию искусственных хромосом дрожжей (УАС; рис. 9-7). гАС-векторы включают в себя все необходимые элементы для жизнеобеспечения эукариатической хромосомы в ядре дрожжей: дрожжевой оп, два селектируемых маркера и специфические последовательности (полученные из теломер и центромер, участков ДНК, а которых рассказывается в гл. 24), необходимые лля стабильности и правильного расхажлення хромосом при делении клетки.
Прежде чем вектор булст использован в клонировании, ан амплифицирустся в виде кольцевой бактериальной плазмиды. Разрезание зцдонуклеазай рестрикции (ВааН! на рис. 9-7) удаляет участок ДНК между двумя телоиерпыми последовательностями (ТЕ! ), оставляя теламеры на концах лннеаризованной ДНК. Разрезание в другом участке (Есод! на рис. 9-7) делит нектар на два сегмента ДНК, называемых векторвыии «рукавами», каждый из которых содержит свой селектируемый маркер. ! еномная ДНК подвергается неполному расщеплению эндонуклеазами рестрикции (Есай! на рис.
9-7), чтобы получился фрагмент подходящею размера. Затем геномные фрагменты разделяются пульсирующим гель-электрофорезом (разновидностью гель-электрофореза; см. Рис. 3-18), который позволяет разделя~ь очень большие сегменты ДНК. Фрагменты ДНК подходящего размера (до 2 1Ол п. и.) смешиваются с полученными «рукавами» векторов и лигируются.
Затем полученная смесь используется для трансформации обработанных дрожжевых клеток очень бал ьшими молекулами ДНК. Выращивание на среде, лля роста на которой необходимо наличие генов обоих селекгируемых маркеров, обеспечивает отбор только тех дрожжевых клеток, у которых есть искусственная хромосома с Гвльшой вставкой между двумя «рукавами» вектора (рис. 9-7). Стабильность ЪАС-клонов увеличивается с размером.
Те УАС-клоны, у которых размер вставки превышает 100 000 п. н., примерно так же стабильны, как и обычные хромосомы клетки, в то время как другие — со вставкой менее 100 000 и. и. — постепенно гибнут во время митоза (так, например, дрожжевые клоны, имеющие всего два векторных конца, сшитых вместе или с короткими вставками, обычно не обнаруживаются). УАС, теряющие тсломеры на обоих концах, быстро разрушаются.
Специфические последовательности ДН К определяют при гибридизации Гибридизация ДНК, а которой в общих чертах говорилась в гл. 8 (см. Рис. 8-29), является наиболее доступным специфичным к последовательности пуклеатидов методом детектирования отдельных генов или сегментов нуклеиновых кислот. Существует много разновидностей основного метода. использующего, главным образом, меченые (например, радиоактивные) фрагменты ДНК или РНК (называемые зондами), комплемептарные искомой ДНК.
Согласно классическому подходу, для обнаружения определенной последовательности ДНК в клонотеке (совокупность клонов ДНК) в агаровую чашку, содержащую множество отдельных бактериальных колоний из клонатеки, с различной рскомбинантпой ДНК в каждой, помещают нитроцеллюлозную бумагу. Несколько клеток из каждой колонии прилипают к бумаге, образуя реплику. Затем бумагу обрабатывают щелочью лля разрушения клеток и денатурации ДНК; молекулы ДН К остаются связанными бумагой вблизи колоний, откуда они были получены.
Добавленный радиоактивный ДНК-занл связывается только с комплементарной ему ДНК. После вымывания несвязавшихся ДНК-зондов гибридизованную таким образом ДНК можно обнаружить авторадиографией (рис. 9-8). Как правило, создание камплсмснтарной нуклсотидной цепи, используемой в качестве зонда, является лимитирукпцим шагом при определениии и клонировании гена. Природа зонда зависит от того, чта известно об исследуемом гене. Иногда подходящим зондом является гомологичный ген, клонированный из лругнх видов. Или, если уже был получен белковый продукт гена, зонд можно ]444] Чапь Т.
9. Технологии иа основе информации из ДНК Агарояяя чашка з "у с колопиямя ~ 1яяглягрмп1яяяяшмя 11ппклзлыязяш" я я грьяс с люлозпсй бумзгп к з1 яр~я пй ш1як<. 11ескзслскп кпяпк яз кзжлой юшсшш гчяьлп~зхп '. к буме~.*. Ф',.' ~в л Нятропсллюлсзняя л бумага Ф Ж* Обркбгпке кашпчиолля 1ясфуяк япя клшпк я Йплу$спия лспззурп1М1вяшкя1 ЛНК. Связанная с бумагой ДНК вЂ” рюшгзкгяять ДНК.метке 11пкубзш1я бумзгя с 1ю пк зк гляппя мстшю, .япсм п1яяяызкя, Метка, связанная с интересуюшей чй ". - -:... — колонией Ф Экспонирование рентгеновской пленки бумаги с радио-Ъ активной меткой. Рис.
9-а. Использование гибридизации для идентификации клона с определенным сегментом ДНК. Радиоактивный ДНК-зонд гибридизируется с комплеиеитариой ему ДНК а затем обнаруживается ааторадиографией. После идентификации меченых колоний соответствующие им колонии на исходной атаровой чашке иожно использовать в дальнейших экспериментах а качестве источника клонируемой ДНК.
спроектировать и синтезировать,исходя из аминокислотной последовательности (рис. 9-9). На сегодняшний день всю необходимую информацию о последовательности ДНК исследователи, как правило, получают из баз данных нуклеотид- ных последовательностей, в когортах подробно описана структура миллионов генов широкого диапазона организмов. Экспрессия клонированных генов дает значительное количество белка Зачастую основной интерес прелставляет продукт клонированного гена. а не сам ген, особенно когда белок обладает коммерческой, терапевтической или исследовательской ценностью. Теперь, когда основы метаболизма и регуляции ДНК, РНК и белков в Е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
