Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 140
Текст из файла (страница 140)
рсшрпкпни. Г(-й ~о~ к (З) Фрагменты приши- 3 „ф~ У наюгся к приготовленному кло»»иру»пшему вектору Л!!К-г»»п»»»»» /Г в Рскпмбппавтпый вектор зг г ~~ ~ | ~ ~ ~~ ~ ~ ~ и О4 ЛНК встраивается в клетку-хозяина. | Об Разы»»ожсппе (кяо»»прпвапис) созлзст много ко пий рскомбппаптной ДИК. я('-:-:':"!(1 . 9),- Ф.;.яг ', в клетку-хозяина, которая размножает фрагмент в ходе множества стадий клеточного деления. Эндонуклеазы рестрикции обнаружены у самых разнообразных бактерий.
В начале 19бйьх гг. Вернер Арбер открыл, что биологическая функция рестриктаз состоит в распознавании и разрезании чужеродных ДНК (например, ДНК инфицирующих вирусов), при атом говорят, что такие ДНК рестриктируются. В ДНК клетки-хпзянна последовательность оснований, которая распознается ее сабствеппой эндонукчеазой рестрикции, защищена от расщепления метилированием ДНК, каталнзируемом специфичной ДНК-метилазой.
Эндонуклеаза рестрикции и соответствующая мстилаза иногда называются системой рестрикции-модификации. Известно три типа эндонуклеаз рестрикции: 1, П и 111. Рестриктазы 1 и 111 типа пбычно представляют собой большие, мультисубъединнчные комплексы, обладающие как зндонуклсазпой», так и метилазнпй активнпстью. Эндпнуклеазы рестрикции 1 типа разрезают ДНК в произвольном месте, которое мо- гяс.
9-1. Схема клонирования ДНК. Клоннрующнй вектор к эухариотические хромосомы независимо друг от друга разрезаются одной к той же зндануклеазой рестрикции. Затем фрагментах которые надо клонировать, встраиваются в клоннрующий вектор. Получившаяся рекомбккантная ДНК (показан только один рекомбкнантный вектор) встраивается в клетку-хозяина, где она размножается (клоннруется). Внимание! Масштаб не сохранен: размер хромосомы Е.
соН по сравнению с размером типичного кпонирующего вектора (такого как плазмкда) на самом деле намного больше. 9.1 КяонированнеДНК:основные понятия [4В5) Е<.оКЪ' Стрелками укжлясы фоси>ся:я!ясроь<е < яя>си, рзшиеяляемые кажлой знлонуклеазой рестрикция; зяезлочко — <жиоязния, к<о орые метил прутся с<штяеп тяуяяней метилззой (тле зто известно); !ч — произвольное оеяоязияе. Обратите яоомзяпе. что яазвзяяе каждого фермента состоит из срехбуквенной аббревиатуры (налисано курсивом) бактериэльного вида, из которою он получен, зя ко<орой иногда следует обозначение штамма и римские цифры (ляя > ою чтобы отличить рззлячныс энлонуклеззы рестрикции, выделенные из одних и тех же бактериазьных видов). Тзк, надпись Вот!В означает, что зто первая (!) энлоиуклезза рестрикняя, полученная из штамма ! ! бактерия Вп<»(!яз шя»)о!вшие/агсеях (436! Часть !.
9. Технологии на основе информации изДНК (5') С С Л Т С С бр) ССТЛ('С ! (<>') ЛТ С ('Л Т(У) ТЛССТЛ (5") (! Л Л Т Т С (У) СТТЛЛ(3 (5') (' ЛТЛ Т С(У) СТЛТЛС (5)С(<СС(3) ССС(-: жет быть уд<мсено более чем на 1000 нар оснований (1000 п. и.) с>т распознавасмс>й последовательности нуклсотидов. Эндонуклеазы рестрикции Н! типа разрезают ДНК примерно на расстоянии 25 и. и. от раси<>зиавасмой нуклсотидной последовательности.
Рестриктазы обоих типов двигаются вдоль ДНК благодаря реакции, которая требует энергии ЛТР. Эндонуклсазы рестрикции П типа, впсрвьк полученные Хэмилтоном Смитом в 1970 г., удобнее, п<юкольку не требуют ЛТР и разрезают ДНК в пределах самой распознаваемой нуклеотидной последовательности. Исключительное удобство этой группы чпдонуклеаз рестрикции было продемонстрировано Даниэлем Натансоном, который впервыс использовал их для разработки новых методов картирования н исследования генов и гсномов.
У различных видов бактерий были открыты тыгячи эндонуклеаз рестрикции, причем один или нсскс>лько таких ферментов распознают более 100 различных погледовательностей ДНК. Распознаваемые пуклеотндпые послеловательностн обычно (У) Л Л С с.' Т Т (У) ТТССЛЛ (У) (; С (. С С С (; С (У) (У) С Т С' С Л С (3') СЛССТС (У) С Л(3 СТ('(У) ".'с'(3 СЛ С (5') С А С Н ь) К С Т С (3') ог 4 до 6 п. н. в длину и представляют собой палиндромы (см.
рис. 8-18). В табл. 9-2 приведены последовательности оснований, распознаваемые некоторыми зндонуклеазами рестрикции типа !!. В некоторых случаях взаимодействие меж;ду эндонуклеазой рестрикции и сс распознаваемой пуклсотидпой последовательностью подробно объяснено па молекулярном уровне; например, в табл. 9-2 изображены последовательности, узнавасмыс несколькими зндонуклеазами рестрикции типа П. Нскоторыс эндонуклеазь> рестрикции создают в двух цепях ДНК разрывы с уступом, оставляя от двух ло четырех нуклсотидов одной цепи неспаренными в каждом получающемся конце. Эти нсспарснные цепи называются «липкими» концами (рис. 9-2, и), потому что они могут комплементарно связаться лруг с другом нли с комплементарными «липкими» концами фрагментов лругнх ДНК.
Другие эпдонуклеазы рестрикции разрезают обе цепочки ДНК в противоположных фосфодизфирных связях, не оставляя неспарен- 9.1 КлонированиеДНН: основные понятии ~437) О а мъ Ф а х ~,'и х я ах хи = х о 6! ха в х ил ,! я х а и о я' М в ! я ф37'1Т ,/ сфт'!',) х хР х о с ! ! о со со о 'о е Е' < со о ,в К !ст со 6,' со ст в я сто' оя !о со, то ст кя Осв "я ОО ,"т ~.'".! со ст тоо и '. й% Л со с! сои О и о о м < ,.е. то Е .;. я х--' а яу Р',3 ~ ст ст < < со Г.) Ь и с с х я,;.*И! .;„'АТ Ч'! ': ~ Ф;тот,нЯд ) ...,, ' '1 д,':!.'Э ";!и'~'тт!О .
" и к йк у я Рх в Я х о яо х в а а яъ к и о х в х к х х в х, в х р и ы х в ~ о х Ю Я ! ! !.! а х н /' а ах и х оц к мв и а мх в в ххх а х в х и'х х я х й)й И Р Я я о в о хЯй Ф;3, ! к к и к о хх 'а й ах о в у х й - й'* о я.х ххй х х кх Ях- ы х в ж— кс х х о л х И и о вил 67 х в я х к я в в х х х Йй в о 3 о х х а в х й х х ю а х в в о и и и в а х я ф Вк х х о о х х Р б Я хй в а о в ° хс к $хД х Г ".:"Р яХв о ~,Д о!о о в в в о и !в й,ы х х в в х Я и в!,о, д и Е в о о р,х 3х5 ! о я, к в х и яя х Р !" х о а х В х х я х о х о в х х й к х х х [4381 Чапь1. 9. Технологии иа основе информации из ДНК ных оснований на концах, такие концы часто называют «тупыми» (рис.
9-2, 6). Средний размер фрагмснтов ДНК, полученных в результате разрезания геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции, зависит от частоты, с кото1>ой специфический участок рестрикции встречается в молекуле ДН К, что, в свою очередь, сильно зависит от размера последовательности распознавания. В молекуле ДНК с произвольной нуклеотндной последовательностью,в которой все четыреоснования присутствуютвравныхколичествах, последовательность, состоящая из 6 и. н., распознаваемая такой зндонуклеазой рестрикции как Ва>лН1, встречалась бы в среднем один раз на каждые 4" (4096) п. и., если предположить, что ДНК содержит 50;4 6 С-пар. Ферменты, которые распознают последовательности длиной в 4 п.
н., создавали бы более короткие фрагменты из молекулы ДНК с произвольной последовательностью„при этом последовательность распознавания такого размера встречалась бы около одного раза на каждые 4" (256) и. н, В природных молекулах ДНК специфические последовательности распщ>навания встречаются реже, потому что нуклеотидные последовательности в ДНК не произвольны, а четыре вида пуклеотидов содержатся не в равных количествах. В лабораторных экспериментах средний размер фрагментов, получаемых разрезаниел» большой молекулы ДНК зндонуклеазой рестрикции, может быть увеличен простой остановкой реакции до ее завершения, а результат называется неполной нарезкой.
Размер фрагмента можно также увеличить при использовании осогюго класса эндонуклеаз, называемых хоуминг-эндонуклеазами (см. Рис. 26-38). Они распознают и разрезают гораздо более длинные последовательности ДНК (от 14 до 20 п. и.). После топ> как молекула ДНК была расщеплена на фрагменты, специфический фрагмент заданного размера можно получить электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле или с помощью ВЭЖХ (с. 135).
Однако в случае типпчноп> генома млекопитающих разрезание эндонуклеазой рестрикции обычно приводит к образованию большого числа различных фрагментов ДНК, а это затрудняет выделение специфического фрагмента электрофорезом или ВЭЖХ. Распространенным промежуточным шагом в клонировании специфического гена или сегмента ДНК является создание библиотеки ДНК (описывается в разд. 9.2). После выделения необходимого фрагмента ДНК можно использовать ДНК-лигазу для присоединения его к расщепленному таким же образом клонирующсму вектору, т, е. к вектору, полученному с помощью той жс эндонуклсазы рестрикции.
Например, фрагмент, полученный с помощью ЕсоК1, как правило, не связывается с фрагментом, полученным с помощью ВатН!. Как это более подробно описано в гл. 25 (см. Рис. 25-17), ДНК-лигаза катализируст образование новых фосфодиэфирных связей в реакции, использующей АТР или сходный с ним кофактор. Спаривание оснований комплементарных «липких» концов сильно облегчает лигирование (рис. 9-2, а). «Тупые» концы тоже можно лигировать, хотя и менее эффективно. Исследователи могуг создавать новые последовательности ДНК, вставляя синтетические фрагменты ДНК (называемые линкерами) между лигируемыми концами.
Встраиваемые фрагменты ДНК с множественными последовательностями распознавания энлонуклеазами рестрикции (обычно используемыми далее в качестве участков для встраивания дополнительных ДНК разрезанием и лигированисм) называются полилинкерами (рис. 9-2, и). Эффективность «липких» концов нри избирательном соелинении лвух фрагментов ДНК стала очевидной в самых ранних экспериментах с рекомбинантными ДНК. Бщс до топ> как зндонуклеазы рестрикции стали широко распространенными, некоторые исследователи обнаружили, что возможно создавать «липкие» концы за счет комбинированного действия эндонуклеазы бактериофага Л и терминальной трансферазы (табл.
9-1). Соединяемые фрагменты содержали к<>мплементарные гомополимерные «хвосты». Петер Лобан и Дэйл Кайзер использовали этот метод в 1971 г. в первых экспериментах по соединению фрагментов ДНК природного происхождения. Вскоре после этого подобные методы стали использоваться в лаборатории Пола Берга при соединении сегментов ДНК вируса обезьяны (5'л>40) с ДНК, полученной из бактериофагь Л; таким образом была создана первая молекула рекомбинантной ДНК с сегментами, полученными от разных видов. Клонируюц4ие векторы позволяют амплифицировать встроенные сегменты ДНК Принципы, которые определяют доставку реком- бинантной ДНК в клонируемой форме в клетку- 91 Клонироваиие ДНК: основные понятия 1439~ хозяина и ос дальнейшую амплификацию, можно проиллюстрировать на примере трех распространенных клопирующих векторов, используемых обычно в экспериментах с Е. со11, — плазмид, бактернофагов и искусственных бактериальных хромосом — и вектора, используемого при клонировании болыпих сегментов ДНК в дрожжах.
Плизмиды. Плазмиды представляют собой кольцевые молекулы ДНК, которые рсплицируются отдельно от хромосомы клетки-хозяина. В природе встречаются бактериальпые плазмиды длиной от 5000 до 400 000 и. и. Они могут быть введены в клетки бактерий в холе процесса, который называется трансформацией. Клетки (обычно это Е. со!1) и плазмидные ДНК инкубируются вместе при температуре 0 'С в растворе хлорида кальция, а затем подвергаются шоку при быстром сдвиге температуры до 37 — 40 'С. По причине, ло конца непонятной, некоторые клетки при таком воздействии поглощают плазмидную ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
