Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 135
Текст из файла (страница 135)
(Метод Сенгера также известен как дидезпкси-метпд.) Когда ддМТР встает на место ВМТР, рост цепи прекращается, так как у него отсутствует 3'-гидроксильная группа, необходимая для осуществления следующего шага синтеза. в) ДНК последовательность которой нужно расшифровать, используется в качестве матрицы, а короткие праймеры, меченные радиоактивной или флуоресцентной меткой, отжигаются на ней.
Если добавить небольшие количества ИМТР одного типа, например ИСТР, к стандартной реакционной смеси,то синтез цепи будет преждевременно останавливаться на тех нуклеотидах, где в норме встраиваются 0С. При избытке ВСТР по сравнению с ИСТР шанс включения аналога на место ВС довольно мал. Концентрацию ИСТРппдбирают таким образом, чтобы с большой вероятностью этот нукпеотид встраивался по какому-то одному положению в каждой синтезируемой цепи. В результате в растворе образуется смесь меченых фрагментов, каждый из которых заканчивается на остаток С.
Каждый остаток С в последовательности приводит к накоплению набора фрагментов определенной длины, так что фрагменты разной длины, разделенные злектрофореэпм, показывают локализацию остатков С. Процедура повторяется пп отдельности для каждого из четырех ИМТР, и последовательность можно прочитать прямо по автпрадиограмме геля. Так как более короткие фрагменты ДНК мигрируют быстрее, то те из них, которые расположены рядом с нижнии краем геля, соответствуют ближайшим к праймеру нуклеотидам (5'-кпнец), а последовательность следует читать (в направлении 5'- 3') снизу вверх. Обратите внимание на то, что полученная таким образом последовательность комплементарна анализируемой цепи.
(Продолжение рис. ВЗЗ но следующей странице) 14201 Часть 1. 8. Нуклеотиды и нуклеинпвые кислоты возможным секпепнровапие, т. с. определение послеловатсльности, даже более длинных молекул ДНК с легкостью, которую несколько десятилетий назад нельзя было лаже представить. Методы основаны на более глубоком понимании химии нуклеотидов и метаболизма ДНК, а также на злектрофоретическом разделении фрагментов ДНК, разлнчаюгцихся только по одному нуклео- 3' Л С О О С Т А С Т Цепочка еэ тнду. Электрофорез ДНК похож на электрофорсэ белков (рнс. 3-18). В качестве основы геля при работе с короткими молскуламн ДНК (до нескольких сотен пар оснований) часто используется полиакрнламнд; агароза обычно используется для более длинных последовательностей ДНК.
В методах секпснировапня по Сенгеру, и Максаму — Ннльберту основным принципом явля- Π— Р— Π— Р— Π— Р— Π— СНа О основание ~нн Рис. 6-33. (Продолжение) ! !райан:р СТААСгСТССАС Т Ой1м.к"о астР, ас'ГР. алтр, ат'ГР + аастр ~! — слттсслсст ы с ~! — сАттссАаа с + ааттр ~! — САТТССАСС4Ы Т ° в — слтаат ~4 — сАаат 12 н ю 9 В 6 5 4 2 г 1 Лвтиралиограмма Ног 1еловательиость е электрофорстичсского геля комнлемснтарной цени ется патучснне четырех наборов мечешах фрагментов ДНК. Реакция образования кажлого фрагмента принадлежащего к одному набору, специфична по оцредсленному основанию, которос находится не 3сконце, таким образом получается, что длина фрагьгента соответствует положению, в котором находится конкретное основание.
Например, из авггонуютеотида, имеющего последовательность рААТССАСТ, меченного по 5'-концу (левый конец), в реакции расщепления по остатку С полу'вются два меченых фрагмента: один будет содержать четыре нуклеотида, лругой — семь; в реакции расгаеплеппя по остатку С получается только цзин меченый фрагмент из пяти нуклсотидов.
Твк хак все олнгонуклсотиды мечены только по одноиу 5'-коццу, видны будут только те фрагменты ДНК, которые содержат концевой 5'-нуклеотнд. Размер фрагментов соответствует положению С и 6 остатков относительно 5'-конца Если наборы фрагментов, соответствуютцие каждому нз четырех нуклсотидов, разделить электрофорезом па соседних дорожках, опи образукп полосы, по которым можно сразу «прочитать» последовательность (рис. 8-33). Мы описали здесь только метод Сепгсрв, потому что оп легче и более пшроко применяется.
Для его осуществления нужны радиоактивно меченные праймеры, дидезоксинуклеотпды и провеление фермснтативпогосинтеза пепи ДНК, комплементарной анализируемой ДНК. Секвенирование ДНК может быть автоматизировано с помощью небольшого изменения метода Сснгера, в котором дидезоксинуклсотпды, используемые для каждой реакции, мстят разными флуоресцентными зондами (рис. 8-34). Этот метод позволяет определить последовательность ДНК, содержащую тысячи нуклеотидов, за несколько часов. На ланный момент полностью секвснированы геномы многих + ааатр + аастр ° В вЂ” САттссАсстсаа А ~ — сАттссАсаа с °  — сАтгссааА ~! — сАттаас °  — сааА з' А с т с С А С С т т А С 8.3 Химия нуклеиновых кислот ) а 21) (4221 Часть 1. 8.
Нуклеотиды и нунлеиковые кислоты Нраймер Образелг нанна«сгной ~» ДПК-пози»ларам, г л р четыре тица гЫ1лгТР =м ф Дснзтурируюший агснз Окрашенные з разные цвета ггогледавзтсльф ности ДНК, полученные — Ф на основании ,Ф. Окрашеццыс фрагменты Миграция:,~ ДНКдвижутсн цо ДНК Я~ капилляру с гелем — в процессе злентрафорезз й Луч лазера Детектор л йззгп 1 ~1Й1 ССТ СТ ТТ САТ С СТ С СТ Т СССА ААТ ССС С Результат, вылзвземый компьютером после прохождения пиков через детектор Рис. 8-34. Способ автоматизации реакций определения последовательности ДНК. Каждый дидеэоксинунлеамгд используемый в методе Сенгера, можно связать с флуоресцентной молекулой, которая окрашивает все фрагменты ДНК, заканчивающиеся на коннретный нунлеатид в один и тот же цвет.
Все четыре меченных разными метками г)бНТР добавляют в одну пробирку. Образующиеся окрашенные фрагменты ДНК затем разделяются по размеру в злектрофоретическам геле, содержащемся в капилляре (усовершенствование элентрофоретичесного геля, которое позволяет осуществлять более быстрое разделение). Все фрагменты одной длины мигрируют по капилляру с одной скоростью и в конечном итоге образуют один пик, а цвет нзждого пика определяется позже с помощью луча лазера. Последовательность ДНК читают после определения последовзтельности цветов пиков, которые проходят через детектор.
Зта информация передается непосредственно на компьютер, который определяет последовательность. организмов (см. Табл. 1-2), и огромное число проектов секвенирования ДНК еще продолжается. Пожалуй, наиболее претенциозный цз цих — зто проект «Геном человека», в котором исследователи секвенировали свыше 3,2 миллиардов пар оснований ДНК чсловеческой клетки (гл. 9). 4) Дидезоксисеквеиирование ДНК Рис.
8-35. Химический синтез ДНК фосфорамидит-(8» иым методом. Автоматизированный синтез ДНК похож на синтез полипептидов на твердом носителе. Олигонунлеотиды синтезируются на твердом носителе (силикагель) в многостадийном процессе, на каждом этапе которого присоединяется по одному нунлеотиду. В повторяющихся химических реакциях по одному добавляются соответствующие нуклеотидные предшественники с защищенными группами, которые блокируют фрагменты оснований, не участвующих в реакции. 01 Первый нуклеозид (который будет крайним с 3'-конца) присоединяется к силикагелю при помощи 3'-гидронсила (череэ связывающую группу К), а бчгидроксильная группа защищается неустойчивой к действию кислот диметокситритильной группой (ПМТ).
СВ Защитная группа удаляется при промывании колонки кислотой (ОМТ-группа окрашена поэтому эту реакцию можно наблюдать спектрофотометрически). Оз Следующий нуклеотид на 3'-конце имеет активную фосфорамидитную группу — соединение трехвалентного фосфора фосфит (в отличие от более окисленного фосфата, где фосфор пятивалентен; в нуклеиновых кислотах обычно присутствует пятивалентный фосфор), в котором один кислород заменен аминогруппой или замешенным аминои. В представленнои типичном варианте один кислород фосфорамидитной группы связан с дезонсирибозой, другой защищен цианзтильной группой, а третья позиция занята быстро замещаемой дииэопропиламиногруппой.
В результате реакции с иммобилизованным нуклеотидом образуется 5',3'-связь, а дииэопропиламиногруппа удаляется. На стадии 04 связь с фосфитом окисляется иодом, что дает в итоге фосфодиэфирную связь. Реакции Ог-® повторяются до тех пор, пана не будут добавлены все нухлеотиды. На каждой стадии избыток непрореагировавших нунлеотидов удаляют перед добавлением в смесь нуклеотидов другого типа. На стадиях ® и Ов оставшиеся защитные группы на основаниях и фосфатах удаляются; на стадии СО олигонуклеотид отделяют от твердого носителя и отчищают.
Химический синтез РНК в некотором смысле более сложен, потому что в этом случае необходимо защищать 2'-гидраксильную группу, не влияя никак на реакционноспособность 3'-гидронсила. Автоматизирован химический синтез ДНН Другой очень важный в химии нуклеиновых кислот метод — это быстрый и точный химический синтез коротких (иигонуклеотидов любой заинной последовательности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
