Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 141
Текст из файла (страница 141)
Некоторые виды бактерий по своей природе способны к поглшцению ДНК и не требуют воздействия хлорида кальция. В альтернативном методе ипкубируемыс с плазмидпой ДНК клетки подвергаются Е««Н1 Р»!1 „ ; К мл»я ол»«л~ л «мяьмлз. ил « рпйз22 4361 пв ( О«ломаний) репликапий (оп') Рии11 Рас 9-3. Пяаэмида рВВ322, созданная для Е. со(й Обратите внимание иа располаженне некоторых важных учасжов рестрикции — для Ра(1 ЕсоИ, ВапйП. БаБ и РтцП; иа мвы устойчивости к ампициллииу и тетрациклмну; и иа реааянатор (оп).
Созданная в 1977 г., оиа стала одной из первых паазммд, специально разработанных для хлоим1вмавя в Е. со(С действию высоковольтного импульса. При таком подходе, называемом электропорацией, бактсриальные мембраны кратковременно делаются проницаемыми для больших молекул. Независимо от метода, лишь немпогис клетки поглощают плазмидную ДНК, поэтому требуется способ отбора удачно трансформированных.
Распространенным подходом является использование плазмилы, содержащей ген, необходимый клетке-хозяину для роста в специфических условиях, такой как, скажем, ген устойчивости к какому-то антибиотику. Только клетки, трансформированные рекомбинантной плазмидой, могут расти в присутствии этого антибиотика, делающего всякую клетку, содержащую плазмиду, «селектируемой» при таких условиях роста.
Такой ген называется селектируемым маркером. Путем изменения природных плазмид исследователи разработали много разных плазмидных векторов, пригодных для клонирования. Плазмида рВК322 Е. соБ представляет собой хороший пример свойств, удобных лля клонирующего вектора (рис. 9-3). Важные преимущества плазмиды РВК322: 1. Участок начала репликации (ой) — последовательность, где инициируется репликация клеточными ферментами (гл. 25).
Эта последовательность требуется для размножения плазмиды и поддержания ее в количестве 10 — 20 копий па олпу клетку. 2. Два гена устойчивости к различным антибиотикам (Ге(л, итр"), что позволяет идентифицировать клетки, содержащие интактную плазмиду или ее рекомбинантный тип (рис.
9-4). 3. Некоторые уникальные последовательности рис познавая ия (Рз(1, Его К1, Вит Н1, 5ай„)ти П), которые являются мишенями различных андонуклеаз рестрикции, предоставляя участки, где плаэмида в дальнейшем может быть разрезана для вставки чужеродной ДН К. 4. Малый размер (4361 п.
и.), который способствует ее проникновению в клетки и биохимическим манипуляциям с ДНК. Трансформация типичных бактериальных клеток очищенной ДНК (сам по себе не очень результативный процесс) становится все менее успешной по мере увеличения размера плазмиды; поэтому 14401 Часть 1. 9. Технологии на основе информации из ДИК К рВК322 о ~ ~) ~~'~ рВК322 разрезается Рвт1 на Ннловукл«ел« участке генаустойчивости рестрикции Рвм кампициллину. о Д ~, О (~ Чужеролпая ДН К при шиваегся Чужеродная к разрезанной рВК322. Там, гле ЛНК сшивка прошла удачно, ген устойчивости к ампициллипу разбит па части.
Участок гена Л!1и-липеи устойчивости к тстрациклипу остается нетронутым. О ~ ~рО~ Клетки Е. сей трансформируются, а затем выращиваются на атаровых Трансформация чашках для отбора тех из иих, клеток Е. ««Ь которые включили в себя плазмиду Собственная ДНК клетки-хозяииа Отбор трв>кформвроввввмх клеток Агар, Все колонии содсржаобладают щий плазмидами тетраци- клин О4 Отдельные колонии переносятся в соответствующие пол женин в дополп Одна из чашек пи клин, лругая и ампициллин. Колонии с рсколгбипап- тными плаз- мидами Агар, солержащий тстрациклин Агар, солержащий ампициллип + тетраОб циклин Клетки,которыерастут втетрациклиие, но не растут в тетрациклине + апмициллине, содержат рскомбинантиые плазмиды с разбитым па части геном ус"гойчивости к алгпициллину, следовательно, они имеют в своем составе привнесенную ДНК.
Клетки с рВК322 без привнесенной ДНК сохраняют устойчивость к ампициллину и растут в обеих чашках. | Ьвьзоиукзекиз Р встр в к пи в ДН К-«нанолнитель» (ненужный для упаковки) Фрагменты чужеролной Не хватает концевой ДНК и/или слипгком ЛНК малы Лля упаковки Рекомбинаитные Л11К упаковка Ф Бактериофаг л, содержащий ,ф' чужсролную ДНК Ф ф, ф Рис. 9-5. Клонирующие векторы на основе бантериофага )ь Для модификации генома бактериофага д используются методы рекоибинантной ДНК вЂ” удаление ненужных для продуцирования фага генов и замена их ДНК-кнаполнителем». чтобы сделать ДНК фага достаточно большой для помещения в частицы фага.
Как показано здесь, в экспериментах по клонированию наполнитель заменяется чужеродной ДНК. Рекомбинанты упаковываются щ игго в жизнеспособные частицы фага только в том случае, если они содержат фрагмент чужеродной ДНК подходящего размера, а также принадлежащие бактериофагу 1. концевые фрагменты ДНН. ~ Рис. 9-4.
Использование рВД322 для клонирования чужеродной ДИК в Е. со11 и идентификации клеток, содержащихее. Й) Влазмидное клонирование нтная становится трудно клонировать сегменты ДНК длиннее 15000 п. и. в том случае, если в качестве вектора используются плазмиды. Бактериофаги. У бактсриофага Л есть аффективный механизм переноса собственной ДНК (45502 п. н.) в бактерию, поэтому он может быть использованвкачествсвектораприклонировании несколько больших сегментов ДНК (рис. 9-5). Удобным его применение делают две ключевые особенности: 1.
Окало трети генома Л несущественна н может быть заменена чужеродной ДНК. 2. ДНК упаковывается в частицы инфекционного фага только в том случае, если ее длина составляет от 40 000 до 53 000 и. н., причем зто ограничение можно использовать для обеспечения упаковки только рекомбинантной ДНК. Исследователи разработали векторы на основе бактериофага Л, которые могут быть легко Рис. 9-6. Искусственные бактериальные хромосомы (ВАС) в качестве клоннрующих векшров.
Вектор является относительно простой плаэмидой с лохусом начала репяииации (оп), управляющим репяикацией. Гены рог, полученные из пдазмид называемых Р-плазмидами, способствуют равномерному распределению плаэмид по дочерним плеткам в процессе деления клетки. Это увеличивает вероятность того, что каждая дочерняя клетка будет нести одну копию плазмиды, даже при наличии малого числа копий. Небольшое число копий полезно при клонировании больших сегментов ДНК, поскольку это ограничивает возможности нежелательных реакций рекомбинации, которые могут со временем непредсказуемым образом менять большие клонируемые ДНК. Вектор ВАС включает селеитируемые маркеры.
Ген!асУ (необходимый дзя синтеза фермента Д-галаитозидззы) располагается в кяонирующем участке так, что он дезактивируется встав- нани ююнируемых ДНК. Встраиванию электропорацией рехомбинантных ВАС в клетки способствует использование клеток с измененными (более пористыми) клеточныии стенками. Скрининг рекомбинантных ДНК производится на основании устойчивости клеток к антибиотику глорамфениколу (Сшз). Чашки, на которых выращивают бактерии, также содержат субстрат для Д-галаитозидазьь что приводит к окрашиванию продуктов. Колонии с активной В-гаяактозидазой и, следовательно, не имеющие мтавок ДНК в ВАС-векторе становятся синими, а колонии ае обладающие активностью Д-галактозидаэы — и, таким ебразом, имеющие искомые вставки ДНК вЂ” белыми. 91 КлонированиеДНК:основныепонятия (аа1) расщеплены на три части таким образом, что две из них содержат необходимые гены бактериофага Л н вместе составляют всего около 30 000 п.
и. в длину. Третья часть, ДНК-енаполнитель», выбрасывается, когда вектор нужно использовать для клонирования. Дополнительная ДНК вставляется между двумя необходимыми бактернофагу Л сегментами, образуя лигированные молекулы ДНК длиной, достаточной для получения жизнеспособных частиц фага. Механизм упаковки используется для селекции рекомбинантных вирусных частиц. Сайтыклоиироваиия (содержат ген гася) Сгип рн шазмидные раг-гены пил»кукл»и.м 1 Большой фрагмент ~и стрикиии чужеродной ДНК с цодходящими Отя~р ус~ф~йиииык З Агар, содержащий к клгажмфеиикплу хлорамфеникол и субстрат для д-галактоандазы Колонии с рекол~бинаитиыми ВАС окрашены в белый цвет 144«2) Часть!.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
