Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 61
Текст из файла (страница 61)
При разрыве гликозидной связи остаток сахара О принимает форму карбониевого иона (С+) и конформацию полукресла. Стабилизации карбониевого иона способствуют отрицательный заряд на Аар-52 и напряженное состояние остатка (р. Известно, что распределение положительного заряда между углеродом и кислородом пиранозного кольца стабилизирует карбониевые ионы сахаров в конформации полукресла. Далее ОН-группа воды присоединяется к атому С-1 карбониевого иона сахарного остатка П, а протон воды — к О)н-35; таким образом, реакция завершается.
В этом механизме увеличение скорости реакции достигается в результате совокупного действия ряда факторов: энергии специфического связывания субстрата, напряжения кольца сахара, эффекта вынужденного контакта; при этом О(п-35 выступает как общий кислотный катализатор, а Азр-52 способствует стабилизации карбониевого иона на промежуточной стадии реакции. Рассматриваемый механизм получил существенное подтверждение в дальнейших исследованиях ферментативной реакции. Во-первых, при определении энергии связывания каждого сахара оказалось„что энергетически невыгодным является связывание только одного остатка, именно сахара Р, что согласуется с предположением о его К ФЕРХ1ЕНТЫ.
П напряженной конформации (полукресло). Во-вторых, оказалось возможным в присутствии субстрата химически модифицировать все карбокспльные группы лизоцима, за исключением Аэр-52 и О!н-35, сохраняя при этом активность; в отсутствие субстрата модифицируется также Аэр-52 (но не 61п-35), однако активность полностью теряется. В-третьих, мощным ннгнбптором фермента является аналог переходного состояния, имеющий следующую структуру: наппппн лепра-Н-ацеппннпнепппатпрапан Сахар Р ннгнбитора — лактон (для лактона конформацпя полу- кресла является нормальной); таким образом, этот тетрасахарид имеет такую же структуру, как остатки А — Гп субстрата прп связывании с ферментом, и хорошо вписывается в субстратную щель; при этом энергия связывания оказывается благоприятной.
В-четвертых, оптимум активности лнзоцнма находится при рН 5; по обе стороны от оптимума активность, как и следовало ожидать, понижается; если прн более высоком рН происходит депротонирование Иц-35, то при более низком рН вЂ” протонированпе Аэр-52. 9.3.4. Карбоксипептндаза А Субстратная специфичность этого фермента проиллюстрирована на приведенном ниже модельном субстрате з о к1 н И нс ы с ы 1 с ~" ~ын~~ соо- Гндролизуемая связь, обозначенная стрелкой, должна находиться по соседству со свободной а-карбоксильной группой; скорость гидролиза увеличивается, если к1 — объемистая ароматическая нли алкфатическая группа.
Дипептиды — плохие субстраты, в то же время а-ь)-ацнлдипептиды оказались хорошимн молельными субстратами. С-Концевой остаток должен иметь ь-конфигурацию; наличие о-ампнокислоты в положении Ка значительно снижает скорость гндролнза. Сложные эфиры, подобные по структуре пептидным субстратам, также хорошо гидролпзуются. 318 11. КАТАЛИЗ Рис. 9.!3. Структура карбокснпептндазы А; показаны относительные расстояния между а-углеродными атомами н локализация функциональных групп активного центра, участвуюгпих в связывании и катализе: атом пинка (2), С!н-270, Туг-248, Сг!п-72, Нап69 н Ага-145. !Исаегзоп И.
Е., 6егз 1., Тье 81гос1пге апг! Гнпспоп о1 Ргоге!и, р. 90, Нагрег апов кок'., РоЫ1з1гегз, 1пс., Иезг Уаг!г, 1969.1 Карбоксипептидаза А является мсталлоферментом, содержашим один атом цинка; она сильно ингибнруется хелатообраэуюгцими соединениями. Цинк можно удалить; прп этом фермент оказывается неактивным, но активность его восстанавливается прц добавлении цинка или некоторых других металлов. Важная роль цинка в активном центре постулнровалась много лет назад; были предложены механизмы гидролиза, которые оказались в хорошем соответствии с результатами последуюшнх рентгеноструктурных исследований фермента и комплексов фермента с ингибцторамн. Данные, полученные с помошью химической модификации, свидетельствуют о том, что один иэ остатков тирозина фермента может участвовать в катализе.
Цространственная структура карбоксипептндазы А схематически изображена на рис. 9.13. Структура компленса с пнгпбптором згэ з. Фенменты. и 61у — Туг позволяет локализовать активный центр, который находится в неглубокой «впадине», проходящей около атома цинка н ведущей в гпдрофобный екарман». Ориентация пнгнбнтора в активном центре показана на рис. 9.14. Наиболее впечатляющим является вытеснение нз активного центра прн связывании субстрата по крайней мере пяти молекул воды, в том числе молекулы, связанной ранее с атомом цинка. Карбокснлатная группа субстрата связывается с гуанндиновой группой Агд-145, а фенольная гидроксильная группа Сйу — Туг находится в гидрофобном кармане. Атом цинка связан с боковыми цепямн Н!3-69, Ын-72 н Н1з-196. Четвертое координационное положение цинка (в отсутствие ннгнбнтора) занято водой; ориентация трех лигандов и воды вокруг атома цинка близка к тетраэдрической.
В присутствии пнгпбнтора в субстратсвязывающем участке обнаруживается ряд структурных изменений; это указывает на вероятность реализацни эффекта вынужденного контакта. Агй'-145 сдвигается на -2 А п вступает во взаимодействие с а-карбоксильной1 группой ннгибнтора, карбоксилатная группа П!ц-270 смещается на -2 А, в направлении пептида, а Туг-248 перемещается на - 12 А, в результате его гидроксидная группа оказывается около — 1МН-группы атакуемой связи. Перемещение тирозина, по-видимому, закрывает зону активного центра, и она становптся недоступной для растворителя„.
это обстоятельство позволяет предполагать, что увеличение скорости ферментативной реакции может отчасти быть связано с эффектом десольватацнн (равд. 9.2.4). Кислород пептндной группы ингибнтора приближен к атому цинка. Зтп данные прнвсли к б Рис. 9.14.
Структуры активного нсктра карбоксипептилазы А в отсутствие (о) и в присутствии (б) Сг!у — 1-Туг. Связывание 01у — 1.-Туг вызывает значительные переиешения Ин-2УО„Туг-248 и Агн-143. (В)ога 1). М., Мена Т. А., Апп. йеч В1о- снепь, ЗЭ, 63, 12701 и. катализ з2о и Нзумнн" амина(праавюн) сзн-зто но /- О 'С=О Е с у унатапаннмй о а,' Рис. й.15.
Предоолагаемые стадии катализируемого карбокснпептндазой А гилролиза пептида, и — связывание С-концевого фрагзтента субстрата. В области активного центра может связываться несколько остатков (до шести) полипептидного субстрата, при атом образуется сложная сеть водородных связей н гндрофобных взаимодействий. Атом цинка образует координационные связи с двумя остатками гистидина и одним остатком глутамнновой кяслоты.
В тексте обсуждены превращения, происходящие на стздинх а — г. формулировке механизма гидролпза, показанного на рис. 9.15. Иц-270 действует как нуклеофил, образуя ангидрид с †С=О- группой расщепляемой пептидной связи, одновременно Туг-248 атакует — ИН-группу гидролпзусмой связи. Атом цинка выступает как электрофил, полярнзующий карбонильный кислород. Далее вода поставляет протон Туг-248 и расщепляет ангидрид, восстанавливая исходную структуру актинного центра; при этом освобождается второй продукт. 9.4.
Заключительные замечания Механизмы рассмотренных выше четырех ферментатнвных реакций могут потребовать пересмотра при получении новой иифор- н-н ° — '.= - -й с — / сн о н — н т у -ззв о 1 С1н-ХГО Н О У -с с— о — с=о" " Щ у ттг-ха в (> "4, соо н г н — н с!н-зто о 'с=-о""" х с сн о 9. ФГРменты. г! 321 мации. В то же время зги механизмы достаточно полно учитывают основные данные, известные в настоящее время для каждого из ферментов.
Хотя все четыре фермента являются гидролитическими и относительно простыми по сравнению с теми, о которых речь пойдет в последующих разделах, изложенные представления иллюстрируют основные принципы действия ферментов, включая различные механизмы, с помощью которых, как полагают, ферменты увеличивают скорости химических реакций. Кроме того, обсуждение приведенных механизмов показывает„что какой- либо один подход вряд ли позволит выяснить основы чрезвычайно высокой каталнтической активности и субстратиой специфичиостп данного фермента. Эти механизмы иллюстрируют также тонкость и сложность действия фермеитов (предсказаииую, вероятно, впервые Эмилем Фишером более 80 лет назад). Понимание механизма действия ферментов стало возможным (хотя и ие в полной мере) только в последние два десятилетия благодаря разработке весьма совершенных методов псследоваипя и формулировке новых биохимических принципов.
ЛИТЕРАТУРА Книги Вегг!Ьап! Б., ТЬе Бггисюге апб Гипсиоп о1 Епх!тпев, )Ч. А. Веп!агп(п, 1пс., Иетч У !ц 1968. Воуег Р. О., еб., Тйе Епхутлев, Зб еб., Асабеш!с Ргевв, 1пс., Иетч Уогй, 1970. Вгау Н. О., У(7)йге К., К)пеисв апд ТЬегшобупаш1св 1п Вюсйепнв1гу, 26 ед„Асадепис Ргеяь, !пс., Иеи Уогй, 1967. Вгшсе Т. С., Венйои!с Б., Вюогавпгс Месйап(вшв, чоЬ.
1, П, %. А. Веп)аш!и, 1пс., Иеж Уогй, 1966. Со!ота17сй Б. Р., Кар!ал М О., едв., Ме!Ьобь ш Епхугпо!ояу, Асабет(с Ргевв, 1пс., Иечг Уогй. (Публикация этой серии начата в 1958 г. и продолжается в настояшее время.) Оевлиеие Р., А!лига!Л Н., О!!еьеп М., ебв., Б(гисЬлге-Гипсбоп Ке1абопвыра о1 Рго(ео1уис Епхушев, Асабепйс Ргевв, 1пс., Иегч Уог1г, 1970. Ептгпнс Мобеы апб Епхуше Б!гис!иге, Вгооййачеп Бушр. Вю!., !5, Вгоо!гкачеп Йв(юпа1 1.аЬога1огу. Вгооййачеп, И. У., !962.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
