Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 56
Текст из файла (страница 56)
Фосфорилфермент стабилен в водных растворах, но реагирует с разлпчнымп соединениями типа ИОН (табл. 9.2) согласно реакции Š— Π— РОа-+ ВОН вЂ” ~ Š— ОН+ КОРО~~ Сравнение скоростей фосфорнлирования различных субстратов позволило выяснить ряд интересных аспектов, характеризующих связывание субстрата и каталптпческую эффективность. Перенос фосфорнльной группы с фермента нв воду (гпдролпз фосфорилфермента) протекает очень медленно, со скоростью лишь в 60 раз большей, чем скорость неферментативного гндролиза серпнфосфата. В то же время фосфпт н кснлозо-1-фосфат, не являющиеся субстратами, ускоряют перенос фосфата фосфорнлфермента на воду в 580 и 1,7 1О' раз соответственно.
Это показывает, что реакцпонноспособность фосфорнльной группы фосфорплфермеита значительно увеличивается в присутствии соединений, структурно сходных с субстратамп и способных, следовательно, связываться ,с активным центром (фосфнт связывается на участке фосфата, .а ксилоза — на тчастке сахара). Ксззлоза фосфорилнруется фосфорилферментом значительно быстрее, чем вода; в присутствии же фосфита она фосфорилируется с образованием ксплозо-1-фосфата в 2 1Оа раз быстрее, чем вода; наблюдаемая скорость лишь в и. легчанты и Таллина 9.2 Относительные скорости фосфорнлнронаннн рада соединений фосфорилфермеитом (фосфогл>окомуталой1' а,а- м' 1 4 ° >еа а,а ° мт а .
>О>и Скорость фосфорилнрованая иоды условно ирннята равиой едиияие, для остальныя соединений приведены отиоснтедьные скорости. Константа сио>юс>и исрвато ворядяа фосорилиеоваиия воды фосфопнлфернеитон пои 39 'с и рн 7.3 раина 3,2 >О-" с-'. lеас>ы йт. и., ддт. Епттпю>.,43, 2>9. >976.1 15 раз меньше скорости фосфорплированпя природного субстрата — глюкозе-1-фосфата. Наконец, ряд ациклнческих монофосфодиолов, у которых между гндроксидной и фосфорпльной группами находятся еще четыре атома, фосфорилируется ферментом со скоростямп в !(13 — 107 раз большими, чем скорость фосфорилнрованюг воды.
Таким образом, связывание соединений, обладаюшнх соответствующими структурами, с фосфатныл> в сахарным участками активного центра приводит к значительному снижению энергии активации реакций фосфорилирования, осуществляемых фосфоглюкомутазой. Данные табл. 9.2 убедительно свидетельствуют в пользу представления о том, что сильные взаимодействия. обусловливающие связывание субстрата с активным центром, влияют и. кхтэлиз также на характер химических процессов, что приводит к чрезвычайно большому ускорению превращения субстрата. Имея в виду изложенные выше представлении, можно перейти теперь к рассмотрению различных механизмов, которые, как полагают, обеспечивают увеличение скоростей реакций, катализируемых ферментами; эти механизмы учитывают энергию взаимодействия фермента с субстратом, проявляющуюся в субстратной специфичности фермента.
9.2.2. Индуцированно» соответствие и ферментативный катализ Предполагается, что многие ферменты в отсутствие субстратов находятся в неактивном состоянии и что функциональные группы их активных центров не ориентированы в пространстве надлежащим образом для взаимодействия с комплементарнымн .группамн субстрата.
Однако при связывании специфического субстрата происходит такое конформационное изменение фермента и, следовательно, сто активного центра, в результате которого соответствующие К-группы центра занимают необходимое для взаимодействия с субстратом положение; зто обеспечивает осуществление каталитического процесса. Такие индуцированные субстратом коиформационные изменения называют индуцированным соответствием; его иллюстрирует схема, приведенная на рис.
8.8. .Убедительные данные, свидетельствующие о конформацпонных изменениях при связывании субстрата, основаны главным образом ма сравнении структур фермента, полученных методом рентгеноструктурного анализа, в присутствии и в отсутствие ингнбнторов. В качестве примера можно указать на соответствующие данные для нарбоксипептидаэы (равд.
9.3А) и лизоцима (равд. 9.3.3). Кроме того, ряд свойств ферментов, находящихся в растворенном состоянии, указывает на различие их конформации в присутствии я в отсутствие субстратов. Например, некоторые ферменты в присутствии субстратов утрачивают способность взаимодействовать со специфическими антителами; многие ферменты в присутствии специфических субстратов оказываются более стабильными в отношении тепловой денатурации, у нпх изменяются показатели оптического вращения, они перестают диссоциировать на субъединнцы; у некоторых ферментов изменяются седиментационные характеристики. Принято считать, что в результате индуцированного соответствия может увеличиваться скорость некоторых ферментатнвных реакций; .однако обусловленное этим механизмом увели.
чение скорости, вероятно, относительно невелико по сравнению с соответствующими эффектами, обусловленными другими механизмами. в. осрманты. и 9.2.3. Эффект приближения Наиболее вероятный механизм, благодаря которому фермент может увеличивать скорость бнмолекулярной реакции„состоит в том, что в активном центре субстраты настолько прпближаются друг к другу (в надлежащей ориентации), что их эффективные концентрации оказываются значительно большими, чем в разбавленном растворе.
По существу это крайне маловероятное состояние, однако благодаря сильным и множественным взаимодействиям между субстратом и структурами активного центра ферменты увеличивают вероятность сближения двух субстратов и эффективно превращают бнмолекулярную реакцию в мономолекулярпую внутримолекулярную реакцию. Для этого эффекта предложен ряд названий (ориентация, близость, сближение, орбитальное взаимодействие и др.); в данном разделе используется термин приближение. Эффект приближения весьма убедительно иллюстрируют модельные пнтрамолекулярные реакции, в которых отчетливо проявляется влияние структуры соединений на скорости реакций.
В табл. 9.3 приведены структуры и-бромфениловых эфиров янтарной и глутаровой кислот (в форме карбоксилат-ионов) и относительные скорости их гидролиза (в сопоставлении со скоростью бимолекулярной катализируемой ацетатом реакции гидролнза Таблица У.З структуры и относительнме скорости тндролнвн инионов монофениловых вфиров дикврбоновмх кислот' Втшсв т. с., Апп. кст н1асьсю., 43, 331.
1976. б к =- -нт -с и Спа1юсть вввпспт ат и' и. кхт«лнз и-бромфеннланетата). Каждый нз эфиров гндролнзуется в результате внутрнмолекулярной нуклеофнльной атаки соседним карбокснлатным ионом согласно следующей реакции: В случае эфиров с более «жесткой» структурой увеличивается вероятность необходимой ориентации и эффективного приближения атакующей карбокснлатной группы к эфирной связи, поэтому онн расшепляются быстрее, чем соединения с большей свободой вращения (с менее «жесткой» структурой). У многих нз приведенных соединений связи оказываются напряженными, и нх можно рассматривать как пружины, упрутость которых несколько пзменястся в переходном состоянии.
На основании приведенных данных было рассчитано, что эффективные концентрации карбоксилатных групп около эфирных групп могут достигать очень высоких значений 110» — 10« моль!л). Это физически нереальные концентрации; однако с нх помощью можно проиллюстрировать преимушества внутримолекулярных реакций по сравнению с межмолекулярными и возможности значительного ускорения процесса в активном центре в результате приближения реагирующих групп. По имеющимся оценкам, в результате эффекта приближения реакция может ускоряться в 10« раз; учитывая также ускорении, обеспечиваемые другими механизмами, можно обьяснить те высокие скорости, которые наблюдаются в случае ферментатнвных реакций. 9.2.4.
Дестабилизация Согласно относительно старой гипотезе о механизме фермеитативного катализа, в субстрате при взаимодействии с поверхностью фермента индуцируется напряжение (деформация илн дестабилизация) разрываемой связи; прн этом предполагается, что в промежуточном соединении или комплексе разрываемая связь оказывается менее стабильной, чем в исходном субстрате.
Эффект напряжения можно проиллюстрировать путем сопоставления скоростей катализируемого основанием гидролнза этилен- 9. ФеРменты. и л91 фосфата и диметилфосфата; первое соединение гидролнзуется в 1От раз быстрее, чем второе. н н нс — сн' ! ! О О ел!илеиФасФа!а сн, сн, ! ! о о о- Р диме!еилфасфев Гипотеза напряжения представляется весьма вероятной в случае ферментатнвного катализа. Интересным примером может служить действие зстеразы печени лошади. Прн изучении гидролнза серии эфиров м-оксибензойной кислоты Яь СхНе сел, С! ОН 1Ч-~ о сй. он О' Ь,, ! сне тон Х е- Р19 9 сне и! 19" обнаружено, что увеличение длины цепи К почти не влияет на Км, в то время как $'и!ел увеличивается на несколько порядков.
Поскольку гидролизуемая связь остается одной и той жс, по-видимому, увеличение энергии связывания в случае длинноцепочечных эфиров уменьшает энергию активации реакции, т. е. энергия связывания углеводородного фрагмента индуцирует напряжение в зоне гидролизуемой связи. Известны н другие случаи дестабилизации субстрата при взаимодейстшш с ферментом, "одним нз наиболее интересных примеров является связывание субстратов лизоцпмом (равд. 9.3.3). Дестабилизация может происходить также при дссольватнровании заряженного субстрата; перенос субстрата из водной среды в относительно гидрофобную среду активного центра может способствовать значительному увеличению скорости.
В качестве модельной реакция, иллюстрирующей влияние десольватнровання, можно привести декарбоксилирование аддукта пирувата с аналогом тнаминппрофосфата (гл. 12), протекающее следующим путем: и. кттзлиз Лддукт 1 медленно декарбоксилируется в воде; однако в этаноле декарбоксилированпе происходит в 1У вЂ” 1О' раз быстрее (освобождаются СОе н Ш). В диметилсульфокснде декарбоксилированне происходит еще быстрее; прн внесении 1 в зтот растворнтель наблюдается даже вспенпвание раствора. Полагают, что увеличение скорости декарбокснлирования является результатом делокализации заряда в структуре Н (предполагаемое переходное состояние) по сравнению с аддуктом 1.
Имеются данные о том, что такого рода механизм увеличения скорости может осушествчяться прп функционировании пируватдекарбоксизазы (гл. 14), поскольку связанный с ферментом тиаминпнрофосфат !кофактор) локализован, по-видимому, в относительно гидрофобной области фермента. 9.2.5. Согласованный общий кислотно-основный катализ В органической химии известно много реакций, катализируемых кислотами или основаниями. Так, например, образование полуацегалей катализируется либо кислотами, либо основаниями, СН, СН, ОН С=О+ СНОН С Н ОСнз ецеыельдегпд мемепап палвецеззель Основание ОН вЂ” ускоряет образование полуацеталя следующим путем: СНз ОН + ОН- = СНзО + НзО СН.
СН, ОСН, С==О 'Π— СН, — ~С~~ Н О- СН ОСН У, +н,О=,С,' +ОНН О Н ОН Я ходе кислотного катализа происходит образование оксониевой соли, которая реагирует далее со спиртом: снз„ + С=О + Нз = С=ЦДН н Н снз ~С=.ОН О вЂ” СН, = 'С., Н =,~~ + Н' 1 н Он н Он 9. ФеРменты. н Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что многие группы в активных центрах ферментов могут функционировать как общие кислотные нли общие основные катализаторы я тем самым вносить вклад в увеличение скорости процесса, Особенно эффективным является согласованный общий кнслотно-основной катализ; модельной реакцией, иллюстрирующей этот тип катализа, чвляется мутаротация (разд.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
