Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 53
Текст из файла (страница 53)
Таьнм образом, навб>олес вероятпымп являются следу1ощпе формы; Т 1, Т2, ТЗ, КЗ, К4 и К5. 1.О б,о 4,О ь г,о 4 1.0 Ь О.'З цб О,4 цз 0,2 О.1 2 4 6 б 1О О 1 2 3 4 б 1 Ц2 Цт 1,О ЕО ЦО 09 1/!З» 99 и б э Рпс. 8.!О. Кпнсткка действпя аллостервческцх ферментов, а --зависимость Р от 15): б---зависимость !1'!2 от !/[Б], э — график согласно уравненпю (37). Прпветены тяпы графиков прн пэ=! (кооператнвность отсутствует), «я=2 (положнтельная кооперативность) н «н=0,5 (отрнцательная кооперативность). Обратите внимание на то, что прн ««=-1 на рнс. и наблюлзется снгмопднан завнснмость. гдозй!а«о 77., р.
352, 1п Р. Воуег, ед., Тйе Епхущез, чо1. 1. Зд еб., Асадегпес Ргезз. 1пс., Меж Уогй, 1970.) для их обратных величин отгазывак1тся нелинейными. Кпнетнка нх действия описывается уравнением, подобным уравнению (9); сделав некоторые преобразования этого уравнения, получаем ,З)вя (Зб) и. клтллиз или в логарифмической форме У 1а =ьн1ч!Я вЂ” 1ад ьих (37) где пн — единственный параметр, которым уравнения (36) и (37) отличаются от уравнения (9); это коэффициент Хилла, нпервые введенный прп описании нелинейных кривых насыщения гемоглобина кислородом (гл. 31). Численное значение пи не может превышать и — максимального числа лигаидов (эффекторов нлн субстратов), которое может связать белок (обычно оно равно числу субъединиц аллостерического фермента) .
Зависимость 1к(1'7()7 — )7~) от 18'(31 является прямой с наклоном и„ (рис. 8.10). пн отражает характер аллостерических свойств фермента в присутствии эффекторов. Как схематически показано на рис. 8.9, при связывании эффектора или субстрата с одним из аллостерических центров происходит изменение конформации соседней субъединицы, приводящее к активации субстратного центра этой субъединицы; это изменение конформации является показателем кооперативного взаи7яодействия между каталитическими центрами фермента, Положительная кооперативность характеризуется пн'- 1, т. е.
связывание первой молекулы субстрата или эффектора усиливает связывание второй молекулы субстрата и наблюдается ускорение реакции. Это обстоятельство отражает график зависимости )7 от 131 для пируваткиназы (рис. 8.11); положительными эффекторамн фермента являются фосфоенолпируват (РЕР) и фруктозо- 1,6-дифосфат (РВР). График зависимости г' от 1РЕР) представляет собой гиперболу, в то время как соответствующая логарифмическая зависимость (уравнение (37)1 при 1РЕР1> 025ммоль|л — прямая с наклоном 2 (пи=2). Следовательно, заполнение одного аллостерического центра РЕР повышает каталитическую активность других центров по отношению к РЕР. Более того, при постоянной 1РЕР) увеличение концентрации другого эффектора РВР, который связывается с другими аллостерическими центрами, приводит к активации фермента по отношению к РЕР как субстрату.
Построение логарифмической зависимости дает пн= 1,98; эта величина характеризует положительную кооперативность по РРР. При отрицительной кооперативности эффекторы или субстраты понижают связывание последующих молекул субстрата с субстратными центрамн или субъединицами аллостерическаго фермента, н в этом случае всегда пи<1 (рис. 8.10).
Хорошо изучен фермент аспартат-транскарбамоилаза (АТСаза) из Е. со)0 на примере структуры и функции этого фермента можно проиллюстрировать ряд свойств яллостерических фермен- з. ФеРменты. 1 0,100 0,0в 4 а Сыт Ю' т,оо -00 -800 со -Ь,о -З.Π— 4,0 ЬИ(С то') Рис. 8.11. Кинетизсскнй анализ действия дрожжевой пнруааткииазы; видна положвтельвая кооперативность при свнзывании фруктово-1,6-дифосфата (НЭР) (положительный зффектор) и субстрата фосфоеиолпаруаата (РЕР). а — зависимость г' от (РЕР) в присутствии и в отсутствии Н)Р.
и н з — графики согласно уравнеиюо (37), позволяющие определить лк длн РОР н РЕР. 1йа1(геипб К., Епкуюез: Рйуейса) Рппс(р1ев, ЪЧ!еу — 1п(етзс)енса, р. 85, Хетт Уотй, 1972.) 18 — 1148 5. 5. -йо -З,Π— Ьо О 1,0 ЕН(Сжг ° тоЧ- и. катализ 274 .гов. АТСаза каталнзнрует первую нз шести стадий бноспнтеза цп- тидинтрнфосф ага (СТР) . о Нам — С вЂ” Π— РО Н н а + н ы †с †— л 1 Пчл со,н н н Н,Ы вЂ” С вЂ” М вЂ” С вЂ” СО,Н вЂ” Стг 1 ! со,н карбаиокл- Члиарап3 кврбаиоклв со а раси иоваи иилллла всларалкиовая кислоо1а СТР— отрн1штельный эффектор АТСазы; следовательно, когда накапливается много СТР, пРоисходит торможение образования карбамоилфосфата.
Нанротпв, если концентрация СТР мала, образование карбамоилфосфата может ускоряться, увеличивая синтез СТР. АТР является положительным эффектором АТСазы, увеличивая (ирн высоких концентрациях) каталитнческую активность фермента. Действие СТР на АТСазу является одним из многих нримеров рсгуляцнн, когда конечный продукт метаболического пути, включаюшего ряд последовательных ферментативных реакций, может временно снижать скорость своего собственного синтеза. На примере рассматриваемой системы видно также, как одно из соединений (в данном случае АТР), участвующее в ряде метаболнческих процессов вместе с СТР, может влиять на синтез последнего. Такой тии метаболической регуляции на уровне ферментов обсуждается в гл, 1!. АТСаза (молекулярная масса 300 000) прн блокировании ионами ртути Нцх' тноловых групп диссоцнирует на субъединицы двух типов, как это схематически наказано на рис.
8.12. Один тин субьединиц Са является тримером (молекулярная масса 99 000); тример обладает каталитической активностью н не чувствителен к действию СТР; в состав молекулы нативного фермента входят две ,С,-каталктнческне субъединицы. Каждый трнмер связывает сукцинат — нереакционноспособный аналог субстрата аспартата (молекула натнвного фермента может связывать шесть молекул сукцината). Другой тнн субъединиц Ка является «активным> димером", в молекуле нативного фермента имеются три К,-регуляторные субъединнцы (молекулярная масса 33000).
«Активный» димер связывает СТР, но не субстраты (молекула натнвногофермента может связывать шесть молекул СТР). Для реконструкции иативного фермента необходимо освободить тиоловые группы (удалив Нд) и иметь в смеси субъединицы обоих типов. В натнвном ферменте имеется шесть ионов 7п'+, н они необходимы при реконструкции фермента из субъеднннц. Сильные дснатурнруюшце агенты вызывают диссоцнацию активных Са- и Кл-субъединиц на к Ферменты. 1 неактивные мономерные субъединицы С (молекулярная масса 33000) и К (молекулярная масса 17000), При днссоциации фермента в результате обработки солями Н32+ каталитическая активность увеличивается примерно в четыре раза, График зависимости р' от 131 для Сз-субъединицы имеет форму гиперболы (рис. 8.13, кривая!), в то время как для натив- ного фермента такой график имеет сигмоидную форму и смещен вправо (кривая 2).
В присутствии СТР график смешается ближе к оси абсцисс (кривая 3). В присутствии положительного эффектора АТР происходит вытеснение СТР; график рассматриваемой зависимости приэтом смещается влево. Таким образом, ЛТР и СТР конкурируют за один и тот же рег»аляторный центр. Сигмоидный характер кривой дли АТСазы в отсутствие СТР показывает, что +2 наюиеник уорнер ентнвная капалиюнчесевя сцбъедн- ниав апьпнвнаа регцпяюсрпая сцаь- еднннаа ~дсн 2 нее»минна» нвяалитичеснвя сцд:ьедннича неаюпнаная регцлепарнвя сцаьгднннаа т-ааюа»нне Я се»асан»в Рнс.
8.12. а — Схематическая модель субъеднннчкой структуры вспвртвт-транскврбвмонлазы, поквзызвюшвя вызываемую добзвлевкем соли ртути днссоцнкцюо на квтвлиткческя активные трнмерные субъеднннцы (молекулярнзя масса 99000» н регуляторные днмерные субъеднннцы (молекулярная масса 34000); прн обработке дензтурнруюшнмн агентами, нвпрнмер додецклсулырзтом натрия (ЛСН), образуются незктнвные мономерные С- н К- субъеднннцы.
б — моделя предполагаемых структур фермента в К (релвкснроввнвом)- н Т(компактном)-состояннях (см. ркс. 8.9). Субстрат нндуцнрует К-состоянне, в СТР— Т-состокнве. и. клтллиз 5.0 и з.о 2.0 2,5 .5,0 7,5 10.0 12,5 15,0 25,0 .(вспврмвж) - 10 Рис. 8.1З.
Зависимость скорости реанции, иаталнзируемой транскарбамоилазой, от концентрации субстрата. 1 — в присутствии солей ртути: функционирование фермента полчнняется обычной нниетнке Мнзазлнса и пи= 1; г — нативиый фермент пз)1; 3 — в присутствии СТР; кривая сдвинута к абсцнссе; К имеет более высокое значение, что отражает уменыпеиие сродства фермента и субстрату, .и е. для достижения той же.самой скорости требуется более высокая концентра- ция аспартата. лн>1.; отрицательный эффектор увеличивает К (т. е. требуются 'более высокие концентрации 3 для насыщения фермента).
Ряд данных позволяет полагать, что АТСаза может находиться .в различных конформационных состояниях: в присутствии субстратов в релаксированнож или Й-состоянии, в то время как в присутствии СТР в компактном или Т-состоянии 32 тиоловые группы фермента реагируют с ионами Низ+ в присутствии карбамоил<фосфата и аспартата быстрее, чем в их отсутствие или в присутст:вии толы<о одного из субстратов. СТР уменьшает скорость реакции Низ+ с тиоловымн группами.
Следовательно, в К-состоянии фермент имеет менее напряженную конформацию, при этом тно.ловые группы оказываются более доступнымн для взаимодействия с реагентом. Кроме того, в присутствии карбамонлфосфата и сукцината коэффициент седиментации фермента оказывается пример.но ца 47в меньшим, чем в присутствии СТР. Поскольку в этих ус.ловиях не происходит диссоциации фермента, различие в значениях коэффициента ссдимеитацни позволяет считать, что в К-состоянии молекула фермента является более асимметричной н :имеет более высокий коэффициент тренин (равд. 5.2). Нативная АТСаза в отсутствие сукцината связывает только три тчолекулы карбамоплфосфата, однако в присутствии сукцината 8. Фвемвнты.
з она связывает шесть молекул карбамоилфосфата; следовательно, АТСаза проявляет гомотропную положительную кооперативность. Свй- Свйв1СР)з ~-С,Кв1СР)зБ Свйв1СР)зБ Св©СР)~5ф - СвЕв1СР),®, где Сейв обозначает 12 субъединиц нативного фермента, СР— карбамоилфосфат, 3 — сукцинат и Свйв — релаксированное состояние. Для связывания СР как в присутствии, так и в отсутствие сукцината пи= 1; связывание одной молекулы сукцината создает условия для полного насыщения фермента карбамоилфосфатам; связыванне последующих молекул сукцината происходит кооперативно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
