Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 49
Текст из файла (страница 49)
по и Е" сз О Концентрация сзскзпрмпа ьь) Копценспрацня Чмрменгпа Щ Рис. 8.3. Относительная напальная скорость как функция концентрации субстрата (о) н как функция концентрации фермента (б). Принято, ято Ув ЕО; концентрация субстрата, прп которой скорость равна 'й К~~, япслс но равна К . В отличие от гиперболической зависимости Г от (В) зависимость Р' от (ЕД линейна.
и. клтллиз лекса ЕЬ, а также некоторых дополнительных допущений, которые были введены позднее. Принято, что концентрация субстрата Б намного болыпе, чем концентрация фермента Е; в рассмотрение включены только начальные скорости, т. е. скорости, определенные в условия«п когда только очень небольшая доля Б превращается в Р. В этом случае из Р практически не образуется ЕВ и стадией Е+Р— «-ЕЕ можно пренебречь. Общая концентрация фермента в системе [Е«1 равна [Е«1 = [Е] + [ЕБ[ (2) где [Е] — концентрация свободного фермента, [ЕБ1 — концентрация комплекса ЕЕ.
Скорость реакции х' равна Р = л«[ЕБ] (3) Это, по существу, уравнение скорости для реакции (1), однако нм нельзя воспользоваться для расчетов, поскольку нп Фм ни [Ео) не могут быть непосредственно измерены. Максимальная скорость К„равна У«ь,к —— )««1Е«1 (4) Ее можно определить„поскольку [~ ~ не может превышать той скорости„которая наблюдается прн полном насыщении фермента субстратом. Наконец, принимается допущение, что реакция протекает в стационарных условиях, т.
е. скорость изменения [ЕЯ равна нулю («([ЕЯ/«((=0) и, следовательно, [ЕЯ не изменнется в течение времени, необходимого для измерения скорости. Скорость пт образовании комплекса ЕЕ пропорциональна [Е1 и [$], как в любой реакции второго порядка: «у = ь«]е1 [Б[ = э«([е«[ — 1еБО [Б[ (5) Скорость пл распада комплекса ЕЕ равна «в э-«[еБ1+ ««[еБ] = (4 «+ Ю [еБ] (б) Поскольку в стационарном состоянии «([ЕЯ/И=О, то п«=ол( следовательно, А~ ([Е«1 — [ЕБ]) [Б] = (А «+ А ) [Б] Преобразуя уравнение (7),получаем [Б] ([Ед — [ЕБ[) Л «+ Л« [ЕБ] ««« где К (включающая все три константы скорости) называется константой Михаэлиса; это весьма важный параметр, характеризующий каждую пару фермент — субстрат.
Преобразуя уравнение (8), получаем выражение для [ЕЗ]: [Е«] [Б1 [ЕБ1 = + (з) в. ФеРменты. 1 Подставляя в уравнение (9) ьгргз вместо [ЕБ) [из уравнения (3)) и )г а ~йа вместо [Ег| [из уравнения (4Ц, получаем окончательное выражение уравнения Михаэлиса — Ментен У»,(З! Д'м+ (З) Рассмотрим теперь методы определения К„, н К по результатам измерения ьг при различных концентрациях [Я. По гиперболической кривой, приведенной на рис. 8.3, можно определить т(, однако определить с необходимой точностью Р'ю, нельзя, поскольку в эксперименте часто не удается достичь концентрации субстрата, достаточной для насыщения фермента.
Используя, однако, »а' , амгав»в ааааа абаа.ааа Рис. 8.4. Зависимости, используемые для определения А' и К»., ферментатнвных реакций. Лла нескольких концентраций субстрата вычисляют скорости н строят соответствуюптие зависимости. По наклонам прямых и отрезкам. отсекаемым нв ОСЯХ, НаХОдят ((а И К»„. ЗаВИСИМОСтИ ПОСтрОЕНЫ СОГЛаСНО: П вЂ” ураВНЕНИЮ (11)1 б — уравнению (12)1 в — уравнению (13). и. клтллиз выражение, обратное уравнению (10), получаем следукицее линейное уравнение, называемое уравнением Лайнуивера — Берка! 1 К,„! 1 — — — — +— (11) У У~„(В! У ах График зависимости 1/'у' от 1!'18), приведенный на рис. 8,4, представляет собой прямую с наклоном К !'У, отсекаю!цую на оси ординат отрезок 1/'у' „.
Поскольку на графике легко измерить угол наклона и отрезок на оси ординат, то можно достаточно точно определить Ум„н К . Можно также умножить обе части уравнения (11) на (81, тогда — — — +— (а! Км 18! (12) У ! ааа х Умах После умножения обеих частей уравнения (11) на Уа„х и соответствующих преобразований получим у — Км !а( + Упах Графини уравнений (12) и (13) также представляют собой прямые; их можно использовать для определения К и Уа,ах.
как показано на рис. 8.4. 8.4.2. Природа К„ Особый интерес представляет следующее уравнение, полученное путем решения уравнения (10) относительно К: К = (х! ( 1,"" — 1) (14) При такой концентрации 181; когда у'=Чх У уравнение (11) преобразуется в следующее: К»= (ь! Следовательно, К совпадает с концентрацией субстрата (в молях на литр), если скорость реакции равна половине максимальной )тааах. К является сложной константой, поскольку К =(й ~+ух)/Аь Следует рассмотреть три возможности. Во-первых, если й, значительно больше Аь то можно пренебречь Аь и К =А >1йь Тогда К вЂ” термодинамическая константа равновесия для обратимого образования комплекса ЕБ. Во-вторых, если кз значительно больше й ч то К =Ах/Аь и К,„— стационарная константа, содержащая две независимые константы скорости.
И наконец, в-третьих. если й ! и Аз — величины одного порядка, то К определяется всеми тремя константами скорости. При исследовании различных ферментных систем наблюдаются все три рассмотренных выше случая. Уравнение скорости Михаэлиса — Ментен (10) выведено при допущении, что скорость стадии Р+Е-а-ЕР практически равна нулю, поскольку определяется начальная скорость прямой реакции Это уравнение, однако, применимо также и в случае ферментативных реакций, константа равновесия которых близка к единице, т. е. для обратимого взаимопревращения 5 и Р. Так, уравнение Холдена связывает Кр с константами скоростей для прямой и обРатной Реакций, а также с Кт и Ушаа: !Р!р зара Ра „К (15Р 151 й а Р,аК где верхние индексы Ь и Р относят соответствующие параметры к субстрату и продукту соответственно.
КР и Гр,а для обратной реакции определяют таким же путем, как было описано выше для прямой реакции, Для обратимой системы правильность определения кинетических констант по уравнению (11) может быть проверена по уравнению (15), поскольку Кр легко рассчитать по равновесным концентрациям. Для фермента фумаразы, которая катализирует обратимое взаимопревращение фумарат+НЕО малат, константа равновесия, рассчитанная по известным концентрациям малата и фумарата, составляет Кр —— 4,4. Значение Кр можно найти, используя следующие определенные экспериментально параметры: К"' =2,5 1О-а моль/л, КФт" =0,5.10 ' моль/л, $'"„,„„= = 54 000 мин — ' и $'~'„' =48 000 мин '. Уравнение (1) отражает механизм фсрмснтатинной реакции в крайне упрощенном виде, поскольку несомненно, что в ходе катализа фермент образует не один, а большее число промежуточных комплексов.
Например, вначале фермент связывает субстрат, образуя комплекс ЕБ, затем переходное состояние ЕЗР, далее ЕР и, наконец, Е+Р: Е 4. 5 ч:=:ь Е5 а~--ь Е5Р чань ЕР час::ь Е+ Р (16) Включение дополнительных комплексов, как например, в уравнении (16), не изменяет общей формы уравнения Михаэлпса — Мснтен (10), вывод которого был сделан на примере упрощенного уравнения (1). 8.4.3.
Порядок реакции при фермеитативном катализе Порядок ферментативной реакции может изменяться во времени; для обсуждения этого вопроса следует воспользоваться кри- и. КАТАлиз вой Михаэлиса — Ментен (рис. 8,5). Рассмотрим соотношения, получаемые из уравнения (9) для высоких и низких концентраций субстрата, поскольку именно такие условия характерны для нача,ла и завершения катализируемых ферментами реакций. Если (5) много больше К„, т.
е. концентрация субстрата очень высока (плато на кривой рис. 8.5)„то — (х = (хпах = й, (Ег( и 181 г(г (17) 1Скорость реакции постоянна (прн данной концентрации фермента), В этих условиях фермент насыщен субстратом и реакция протекает с максимальной скоростью, т. е. дальнейшее увеличение 15) не изменяет скорости. Прп снижении концентрации субстрата до значений, значительно меньших по сравнению с К (нижняя часть кривой на рис. 8.5), видно, что и!Я Р .к(В) йа(Ег) 181 ((В) т. е. скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата. бхмах Рис.
В.б. Теоретический график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата. Когда К = 'г'ах, скорость не аависнт от кон. пентрации субстрата (реакция нулевого порядка). Когда концентрация субстрата мала по сравнению с ((, скорость пропорциональна концентрации субстрата (реакция первого порядка). 3.4.4. Кинетика двухсубстратных ферментатнвных реакций Большинство ферментов катализирует реакции, в которых участвует не один, а большее число субстратов, например А+В С+ +О. В ходе этих реакций также происходит образование фермент-субстратных комплексов, подобно тому как это имеет место ц односубстратных реакциях, и при исследовании кинетики двухсубстратных реакций могут быть определены К для каждого из субстратов и 1'„„ для реакций. Константы К для каждого из субстратов определяют графически (уравнения (11 — 13)1 из за- а ФеРменты.
1 висимости начальной скорости от концентрации одного нз субстратов при фиксированной (обычно насыщающей) концентрации другого субстрата. Выведены уравнения скорости для двухсубстратиых реакций. аналогичные уравнению Михаэлиса — Ментен; использование этих уравнений способствовало выяснению общего механизма изучаемых реакций и позволило определить значения соответствующих кинетических параметров К и У . Эти уравнения весьма сложны, и интересующиеся могут обратиться к более специализированным руководствам.
Полезно, однако, рассмотреть два основных механизма двухсубстратных реакций: механизм двойного замещения и последовательный механизм. Если реакция А+В С+Р осуществляется по механизму двойного замещения, то вначале субстрат А присоединяется к ферменту, образуя комплекс ЕЛ, затем освобождается первый продукт С." при этом образуется стабильный интермедиат Г, отличающийся от Е. Далее иитермедиат Р взаимодействует со вторым субстратом В, образуя фермент-субстратный комплекс ГВ, из которого образуется второй продукт () и освобождается фермент Е. Реакции этого типа могут быть записаны различным образом, приводимая ниже форма записи хорошо иллюстрирует механизм двойного замещения: С В В+ А (ЕА ГС) -х-+ Г+  — (ГВ Г(>) иФЕ где А, В, С и () — субстраты н продукты, Š— фермент, Р— стабильный иитермедиат; обозначения, взятые в скобки,— предполагаемые интермедиаты. По горизонтали последовательно расположены формы фермента, образующиеся в ходе реакции, а стрелки указывают на присоединение субстратов и диссоциацию продуктов Этот механизм называют также «пинг-понгэ-механизмом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
