Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 57
Текст из файла (страница 57)
2.2.2) тетраметилглюкозы: СН ОСН СН ОСН Н н,с нс Н ОСН, еп3,4,6-О - !пемрамемилр-В- гп!окопираноаа Н ОСН, з Е,З,4,6-0-вемрамепиа се-р-гп!окопираиоаа р-вномер о!-аномер При раскрытии пиранозного кольца б-аномера интермеднат получает протон от атома азота (кислота), а карбопильный кислород (основание) акцептирует протон. Далее при замыкании кольца с Кислоты и основания ускоряют мутаротацию; если любой из аномеров растворить в бензоле н добавить смесь фенола и ппридина, то мутаротация происходит очень быстро.
Изучение кинетики реакции показывает, что скорость процесса зависит от концентраций фенола, пиридина, а также тетраметилглюкозы; это позволяет сделать вывод, что фенол н пириднн действуют совместно как кислотный и основной катализаторы. Далее установлено, что если функциональные группы фенола (кислотную) и пиридина (основную) ввести в одну молекулу, как это имеет место в случае а-пирндона (ет-оксипиридина), то образуется значительно более эффективный катализатор, хотя каталнтические группы в а-пирндоне являются существенно менее сильными, чем в феноле и пирнднне, по своим кислотным и основным свойствам. Полагают, что катализ мутаротации а-пиридоном протекает следующим образом: и. катализ образованием и-аномера агом азота акцептирует протон от интермедиата (с раскрытым кольцом), а фенольный гидрокснл поставляет протон.
Установлено, что такой согласованный общий кислотно-основной катализ осуществляется прн функционировании ряда ферментов, в частности рибонуклеазы (разд. 9.3.2). Маловероятно, что в результате катализа такого тяпа скорость реакции увеличивается более чем в 10 †1 раз, однако наряду с другими механизмами он может вносить определенный вклад в увеличение скорости ферментативных реакций. Многие аминокислоты могут функционировать в качестве общих кислотно-основных катализаторов в активных центрах ферментов; к числу таких аминокислот относятся глутаминовая и аспарагиновая кислоты, гнстидпн, лизин, тнрозин и цистеин.
В протоннрованной форме они являются кислотными катализаторами, а в непротонированной форме †основны катализаторами (равд. 5.2). Очевидно, что каталитическая эффективность К-групп этих аминокислот зависит от рХС соответствующей функциональной группы и от рН, при котором протекает ферментативная реакция. 9.2.6.
Ковалеитный катализ Некоторые ферменты, образующие ковалентные фермент-субстратные интермедиаты, перечислены в табл. 9.4, где указаны также группы ферментов, которые подвергаются ковалентной модификации, и характер структуры ковалентного ннтермедиата. Одним из первых ферментов, для которого было показано образование ковалентного фермент-субстратного ннтермедиата, является химотрнпсин; прп действии это~о фермента на и-нитрофенилацетат происходит быстрое освобождение п-нитрофенола и последующее значительно более медленное освобождение ацетата.
Наблюдаемую кинетику процесса удалось объяснять, когда был выделен и охарактеризован ацилферментный интермедиат, устойчивый при низких рН. Установлено, что ацетилирование происходит по гидроксидиой группе сернна-195 фермента. Таким образом, гидролнз п-нитрофенилацетата протекает по крайней мере в три стадии: Ад Е+ л-нитрофеннлацетат ~~ Е .и-нитрофенилзцетзт А — з зт Е. +н-иитрофеиилацетат ч==е ацетнл — Е+н-нитрофенол з-з Аз ацетил — Е -1- НзО и===а ацетат + Е з-з Первой стадией является образование комплекса Михаэлиса, второй — ацилирование, приводящее к образованию ковалентного ин- О.
Ферменты. и Таблица Рлф Некоторые ферменты, образумщие новалентные фермемт-субстратные ннтермедиаты невок:увщвк группа тнп новал6н 1ното ггн ~армение та Группа ферментов 0 тл Й вЂ” С вЂ” Π— СНа — СН вфнр кербоновоа «котовы 0 1! Π— Р— Π— СН вЂ” СН ) веир еооротиоа киглоты О !! й — С вЂ” 5 — СН вЂ” СН тновфир на!боновой кислоты О СН,— СН 3 ! ! Π— Р— тт' гт' ! ~Ф' фоефорнвимндавоа й Й вЂ” С=м — (СН,>,— Сн мнффово основание л НΠ— СН вЂ” СН !.
Химотрнпснн. трипсни, субтилизии, зластаза, тромбин, ацетилхолтпр зстераза, плазмин НΠ— СН вЂ” СН 2. Фосфотлгоиомутаза, щелочиан фосфатаза серии Нз-СН,-СН 3. Папани, фицин, тлицеральдегид-3-фосфат-де- гидрогеназа ннстенн 4. Суицинаттиониназа, глто- иозо-б-фосфатаза гнсгианн Н,Н вЂ” !СН,1,— СН 5. Лльдолаза, трансальдолаза, пиридонсальфосфатзависимые ферменты термедиата и освобождению первого продукта, и третьей — гндролиз ннтермедиата и освобождение второго продукта.
У протеолитических ферментов пипл!пни и фиииип в образовании ковалентного интермедиата (с фрагментом субстрата) участ. вует тиоловая группа цистеина, при взаимодействии которой с карбоксильной группой расщепляемой пептидной связи образуется тиоловый эфир; процесс гидролиза протекает по следующей схеме: 0 0 !! Š— Бн+й — С вЂ” НН вЂ” Й ~ ~Š— Ь С вЂ” й+Нвн — Й' 0 0 р Š— Б — С вЂ” Й+ НтО ~ Š— 5Н+й — С вЂ” ОН и, клтллиз Друтой тиоловый фермент — г.ищеральдегид-З-фас фатдегидро- геназа (гл. !4), катализирующий окисление альдепьхного субст- рата, глнцеральдегид-З-фосфата, образует «богатый энергией» тиоловый эфир (по ЬН-группе активного центра).
Образовавншйся ковалентный ацилтиоэфир подвергается фосфоролизу, давая ацпл- фосфат, который сохраняет энерппо ацплтиоэфирной связи кова- лентного интермедиата. Другой формой ковалентиого связывания субстратов является образование шиффовых оснований (альдпминов! между карбо- нильными соединениями (субстратамн) и е-амнногруппой лизина, находящегося в активных центрах ряда ферментов. Так, прп ин- кубации диоксиацетонфосфата с альдолазой (гл. 14) в отсутствие глицеральдегид-3-фосфата (обычного партнера в реакции„ каталп- зируемой альдолазой) происходит следующая реакция; СН,ОН сн,он 1 1 г.— (сн ) — нн + о=с ~=ьц — (СН ),— )Ч=С 1 СН,ОРО,,Н~ СН.ОРО Н, Образование ковалентного соединения было доказано путем вос- становления альдиминной двойной связи и последующего полного кислотного гидролиза модифицированного фермента. В гидролнза- те был обнаружен модифицированный лизин; его е-амнногруппа была связана (в форме вторичного амина) с углеродныч скелетом диоксиацетонфосфата.
Подобные же результаты получены и с друтим ферментом — грангальдолазой (гл. 14). Образованием шнф- фова основания можно объяснить наблюдаемую в фосфоднокси- ацетоне лабнлнзацию водорода у углерода, соседнего с карбо- нильной группой СН«ОН НСОН вЂ” И==С ~ — м — с ) ) СН.,ОРО Н Н СН. ОРоьН, В этой связи представляет интерес рассмотрение функций пи- ридоксальфосфата в аминотрансферазах, механизм действия ко- торых обсуждается детально в гл. 20.
Следует только отметить, что альдегидная группа пиридоксальфосфата, участвующая в пе- реносе аминогруппы„образует шиффово основание с г-амнногруп- пой лизина апофермента. Это не только способ связывания пири- доксальфосфата с ферментом (связывание осуществляется п дру- гимн участками молекулы пнридоксальфосфата), но прежде всего путь ускорения ферментативной реакции, поскольку процесс гран- сальдиминированил является значительно более быстрым по срав- нению с процессом образования шиффова основания. Схема по- луреакции ферменгативпого лереальаннрования приведена на рнс.
9.1. в. Фенмепты. и Важным преимуществом механизмов, включающих стадию образования ковалентных субстрат-ферментных иптермедиатов, является избирательное увеличение вероятности протекания определенной реакции. Ковалентно связанный ннтермедиат обладает лишь весьма ограниченной подвижностью в активном центре фермента и может, следовательно, занимать более благоприятное положение для завершающей реакции с соответствующими группами активного центра. Кроме того, при функционировании ряда ферментов, таких, как глицеральдегид-3-фосфатдепгдрогеназа и сукцпнат-тяокиназа„ прн образовании продукта используется энергия ковалентного интермсдиата.
Увеличение скорости реакции в результате образования ковалептных интермедиатов может оыть весьма значительным (как, например, для альдолазы и грансахщнази), однако в !!ругпх случаях фактор ускорения пе превьппает 10' — 10'. Я.З. Природа активных центров и механизм действия ферментов Для идентификации функциональных групп установления характера взаимодействия между к ! н нс — соо г активных центров, субстратом и фер- к ! н за- СОО Ннм " 'н Х"Л а ! ссОО+ -ннз н +Н ! нн ссоон 6 нс 'н ч ч ч ч О ф Рнс.
9.1. Предполагаемая схема катализа полуреакцин фермеитативиого переамииироваиия: альдиминная структура, не участвующая в образовании водородных связей, осуществляет взаимодействие с аминокислотой — субстратом, а освобожда!ошаяся е-амииогруппв лизина может фунициоиировать в качестве кислотно-основного катализатора процесса переноса электронов, инициируемого пиридоксалем. [Елен Е. Е., ВгооЫгатеп Бугпр. Вю!, !5, р. 39„вгооИгатеп Хакопа1 ьаьога!огу, 13р1оп., М. 'г'., 1962.1 и. катализ ментом, а также вероятного механизма действия фермента используют различные экспериментальные подходы.
Очевидно, что значительную информацию дает сравнение полной трехмерной структуры фермента в отсутствие и в присутствии ингибиторов. Такая информация может быть получена только на основании совокупности данных рентгеноструктуриого анализа и полного определемия амннокислотной последовательности; подобную информацию для ряда ферментов получить весьма нелегко. Для всесторонней интерпретации данных о структурах, полученных крнсталлографическими методами.
часто оказывается необходимым использовать другие экспериментальные подходы. Значительную информацию о ферменте и механизме его действия дает исследование субстратной специфичности и природы ингибиторов, а также кинетический анализ зависимости каталитической активности от рН, температуры и состава раствора. Существенным дополнением слгжит также изучение влияния на активность фермента действия химических реагентов, которые ковалентно модифицируют специфические К-группы фермента, илн протеолитических ферментов, специфически расщепляющих одну или несколько пептидных связей. Ниже будут рассмотрены четыре различных гндролитических фермента (хииограпсин, рибонцклеаза, лизоцим и карбоксалепгпддза А); пх изучение может служить примером использования различных эксперимщггальных подходов с целью выяснения структурно-функциональных особенностей ферментов, Для каждого из этих ферментов установлена первичная структура, выяснена структура активного центра и механизм связывания субстрата.
Кроме того, детально изучены каталитические свойства этих ферментов, н па основе полученных данных предсказан вероятньш механизм действия каждого пз пих. 9.3.! . Химотрипсин Лучшие субстраты и ингибиторы химотрипсипа содержат ароматические или обьемистые алифатические К-группы (табл. 6.3); это указывает на участие гидрофобных сил в образовании фермент-субстратного комплекса. Например, а-К-ацетилпроизводные ь-тирозинамнда и ь-фенилаланииамида являются значительно .чучшими субстратамв, чем соответствующий амид ь-аланина.
Кинетические исследования (разд. 9.2.6) указывают также на образование ковалентного промежуточного соединения. Зависимость от рН константы скорости лз (равд. 9.2.6) позволяет предполагать, что в реакции ацилнрования участвует группа с рК, близким к рК имндазольной группы боковой цепи гистидпиа. Химическая модификация специфическими реагентами указывает на функционирование в активном центре остатков серина и 9. Ферз!и!Пы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
