Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 60
Текст из файла (страница 60)
9.9. Модель связывания динуклеотидфосфата БрСНзА с РНазой-Я (зкнриые линни — связи). Н!9-1!9 показан в одном нз четырех возможных положений, найденных при кристаллографическом исследовании. В нативном белке е-Ы1-1 т группа (,уз-41 смепгена вниз н проекпируется сзади фосфагной группы, однако не контактирует с ней. Метиленовая группа — СНх — (между фосфооом и рибозой) и!пибитора влияет на положение Н19-И9. (йгсйаг!(а г".
И., йгусйоф гг. йг., р. 647, тп: Р. Воуег, ед., ТЬе Енхугпез, то!. 1Ч, Асадегп!с Ргезз, 1пс., Иезч Уогй, 197!.1 Рис. 9,10. Связынание субстрата. а — субстрат находится в активном центре, пурнновые и пиримндииавые кольца — в плотном контазтс с соответствующими связывающими участками, а в-ХНз !.уз-41, так же как Н!з-12 и Н!з-!19, — около отицательно заряженного фосфата. б — в результате согласованного действия !з-!2, выступающего как основание, акцептирующее протон от 2'-ОН-группы рябовы, и Няь119, выступающего как кислота и образующего водородную связь с атомом О фосфата, образуется промежуточный комплекс, в котором фосфор находится в пентзкоордннациоином састоянпи [тригоиальнзя бнпирамнда).
з — образование цнклического-2',3'-фосфорибочного интермедиата сопровождается уходом протона от Н!з-!19 (Н!з-!2 уже присоедиаил протон). г — н активный центр вступает молекула воды, поставляющая протон Н!а-119 и гидроксидную группу фосфату. д — образуется тригоиальная бипирамида, которая претерпевает перегруппировку ири участии Н!з-!2, поставляющего протон. е — образуется продукт — пирймидинрибазо-Зцфосфат. [Побег)з 6. С. К, йеиаы Е. А., !Иеаг)оюз Еь Н., Сойея А Б., Уагг!етйу О., Ргос. Ма)1. Асад. Ьп'. 12 5.
А„62, 1151, ! 909.~ з!з к Фегменты. и модификации, рассматриваются как функциональные группы активного центра. Рентгеноструктурные исследования комплексов РНазы с различными ингибиторами показали, что все они, как можно было ожидать, связываются в одном н том же участке вблизи двух остатков гистидпна. Ориентация в активном центре одного нз ингпбиторов ЬрА, у которого атом кислорода между фосфором и 5'-СН~-группой рнбозы аденина (А) заменен метиленовой группок (()рСНхА), показана на рис. 9.9. Ориентация ннгибнтора в активном центре, вероятно, несколько отличается от таковой для субстрата; однако, как видно на рис. 9.9, Н!з-12 и Н!з-119 располагаются вблизи гидролизуемой фосфоэфнрной связи.
Пнримидиновое и пуриновое кольца локализуются в специфических областях. Ппримидиновое кольцо образует нодородные связи с ОН-группой боковой цепи Тпг-45 и 14Н-группой его пептидной связи. По одну сторону от пнримидинового кольца располагается РЬе-120, а по другую Уа!-43. Поскольку эти остатки образуют углубление, в котором связывается пнримидиновое кольцо, то можно понять, почему происходит инактннация РНазы при отщеплении пепсином С-концевого фрагмента, содержащего остатки с 120-го по 124-й.
На основании данных„полученных с помощью рентгеноструктурного анализа и прн исследовании свойств РНазы в растворе, предложено несколько схем механизма действия этого фермента; одна из них приведена на рнс. 9.10. Данная схема не может считаться однозначно доказанной; однако ясно, что в случае катализа РНазой увеличение скорости реакции обусловлено специфическим связыванием различных групп субстрата соответствующими участками активного центра и, вероятно, согласованным действием Н!з-!2 и Н!з-1!9, осуществляющим общий кислотно-основной катализ. 9.3Л. Лнзоцим Хорошие субстраты лизоцнма — полисахариды клеточных стенок бактерий, повторяющейся единицей которых является дисахарид, состоящий из М-ацетнлглюкозамина и г1-ацетилмурамовой кислоты, связанных между собой р-!,4-связью (гл.
!5). Более простым субстратом является гексамер 5)-ацетнлглюкозамина — гекса-В-ацетилхптогексаоза, в котором гндролнзуется одна гликозидная связь и прн этом образуются тетра- н дисахарид. 3!4 и. к»ТАлиз Структура лизоцима из белка куриных яиц, содержащего 129 остатков, схематически изображена на рпс. 9.11. Исследование структуры комплексов фермента с мояо-, дп- и трисахарндами показало, что связывание сахаров происходит в «щели», находящейся между двумя половвнамп молекулы. Три-1ч-ацетилхнтотриоза располагается при этом таким образом, что ее нсвосстанавливающий конец (сахар Л) оказывается у начала щели, а восстанавлнваюгций конец (сахар С) — в централыюй ее части. Установлено, что при связывании субстрата происходит небольшое перемещение (-0,75 Л) некоторых боковых групп внутри щели; это )называет на осуществление взаимодействия по типу «вынужденного контакта».
На модели фермента внутри щели были размещены еше три остатка сахара, причем каждый последующий сахар «прпсоедянялся» таким образом, чтобы его конформация была (насколько это возможно) такой же, как у первых трех остатков. Все остатки сахара (за исключением одного из шести) реализуют эффективные нековалентные взаимодействия с К-труппами и пептидными группами (рнс.
9.11); образуется много водородных связей и осуществляются неполярные контакты. Поскольку гпдролиз происходит между четвертым и пятым остатками сахаров (Р и Е), особенно важно проанализировать окружение расщепляемой гликозидной связи. По одну сторону от связи на расстоянии -3 Л (от атома 0) находится карбоксильная группа Ып-35, а по другую — расположена карбоксильная группа Азр-52. 1!оскольку Ип-35 находится в гидрофобном окружении, ее карбокснльная группа, вероятно, протонирована; Азр-52 участвует в образовании сложной сети водородных связей между гидрофильиымп группами, и ее карбоксильная группа, по-видимому, ионизирована.
Поскольку эти карбоксильные группы являются ближайшими к атакуемой гликозидиой связи, предполагается, что они участвуют в каталнтнчсском процессе. Далее, если сахарный остаток 0 поместить в субстратной щели, сохраняя для него нормальную конформацию кресла„в которой, как предполагается, находятся все остальные остатки сахаров, то этот остаток должен был бы оказаться в слишком тесном контакте с группами, расположенными в щели.
Если, однако, допустить, что этот остаток находнтся в напряженной конформации полукресла, то оказывается, что расстояния до соседних групп соответствуют нормальным, которые необходимы для контактов. Поэтому полагают, что при связывании субстрата остаток Р находится в напряженном состоянии; прн этом энергия, необходимая для поддержания остатка в невыгодной конформации полукресла, более чем компенсируется энергией связывания других остатков сахаров.
На основании рассмотренных выше представлений предложен механизм гидролиза гексасахарида (рис. 9.!2). Пря связывании Ферментом гексасахарида конформация сахарного остатка Р ока- в. Фепми! !ты. ! ! 315 Рис. 9.11. Структура комплекса лизацима яичного белка с субстратом — гекса-Ы- ацетилчнгогексаозай.
Показаны только К-группы, выстилаюшие зону активного центра и образующие большое число нековалентных взаимодействий с субстратом. А — Р— остатки сахара (А — невосстанавлнваюший копен, Р— восстапавлнваюший конец). Гидро!!из происходит по глнкозидной связи между 0 и Е. Как описана в тексте, Аар-52 и Ип-35, находяшиеся по обе стороны от места расщепления субстрата, участвуют в катализе.
51!сяегзоп К. Е., Сс1з У., 51гпс1пге апд Еппсцоп о1 Рго1е1п, р. 71, Нагрег апд Котс, РпЫ1зЬегз, Иечг Уогй, 1959.] и. катализ З15 о мрм~ + д н н н-о- — .)ы м о н у '~ ',.~ о .~стэн Е о ч 6 н — о Рис 9.12. Предполагаемый механизм действия лизоцима; гидролизу субстрата способствует специфическое связывание в активном центре остатков сахара А — Е. Показаны только остаток 0 и часть остатка Е. Прн связывании (а) субстрат оказывается в непосредственной близости от Азр-52 и О)п-35; последние участвуют в расщеплении й — Е гликозидной связи. Образующийся прн этом кнтермедиат (б) реагирует с ОН- и Н" (аз Воды).
в результате чего образуется продукт н происходит возвращение фермента в исходное состояние (в). [Вгсасгзоп гс. Еэ 6ссз Е, Ягпс1пге апб Рппсцоп о( Рго1ещ, р. 77, Нагрег апб йохч, Рпыгз)гегз, (пс., Хесе Уотс, 1969.) зывается напряженной. 01п-35 выступает донором протона для кислорода гликозидной связи между остатками сахаров 0 и Е, что приводит к разрыву связи и образованию дисахарида (остаткн Е и Г), удаляющегося пз комплекса, и тетрасахарида, в состав которого входят остатки от А до В.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
