Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 59
Текст из файла (страница 59)
В заключение следует отметить, что другие сериновые протеиназы, такие, как гглазлгггн, зластпзи, трощбин и трипсин, функционируют, по-видимому, оо такому же механизму) этн протснназы отличаются от химотрипсина некоторыми деталями структуры, которые, в частности, определяют различия в субстратной специфичности. Например, аминокислотная последовательность и конформации эластазы и химотрипснна очень сходны (рнс. 9.3); эластаза также имеет систему переноса заряда, образованную такими же, как в химотрипгнпе, ампнокнслотнымп остатками.
Огобенности субстратной специфичности обнаруживаются в различном характере связывания виртуальных субстратов, как это видно па рис. 9.5. Сходные структурные и функциональные характеристики представителей рассматриваемого класса ферментов отражают их и Напгт о лч юз о"'н.. н,„е, „ггл о 'н ы---С рсрмаищ аминими прпвэив (гй ивипимй испвр аазпращапвсп испание оипивиие Ро ы о -н- ~ уо) 1 с псгпвпаав мо- Н ~ф лпиэпа псам аеацилиРайвпип К кисповнмй (гя Рвс 9.6. Предползгвемвя последовательность ствдкй прв кзтзлкзе, осуществляемом хвпотркпсщюм я родственными ему серяяовымв протевязземя.
В катвлвтяческом центре функционирует системз перекосе заряда (а), включающая зспзрзгяяовую кислоту, гисткдян, серян, которые связаны водородными связями. Авион (гкдроксвдяой группы серввз) осуществляет пуклеофяльную атаку углерода рвсщепляемой пептвдяой связв субстрата; образуется вцялфермент н освобождвется вмкпвый ородукт (б).
Гвдролкз вцялфермептв (з) возврвщвет активный центр в исходное состоякяе (г). 20 — 114В и. катализ общее генетическое происхождение (гл. 27). Природа, однако, использовала такой же тип каталитического центра (система переноса заряда) у другого протеолптпческого фермента — субтилизина, который функционально сходен с хпмотрипснном, однако имеет совершенно другую последовательность аминокислот и другую конформацпю Тем не менее аминоьпслотная последовательность субтилизпна позволяет полнпептпдной цепи свернуться таким образом, что образуется система переноса заряда, геометрически по- лобная соответствующей системе в хпмотрцпснис (рпс.
9.4). 9.3.2. Рибонуклеаза Ьычья панкреатическая рибонрк.гааза, как было рассмотрено выше (разл. 7.3.1), гидролизует РНК; ее ампнокислотная последовательность приведена на рис. 9.7. Еше до установления трехмерной структуры фермента, когда была известна только его аминокпслотная последовательность, серия интересных исследований позволила получить значительную информацию об активном центре и механизме действия рибонуклеазы.
В определенных условиях сцбтилнзпн гидролизует в рибоиуклеазе одну пептидную связь, находящуюся между 20-м и 21-м остатками. Фрагмент, содержащий остатки с 1-го по 20-й (5-пептнд), остается в комплексе с крупным пептидным фрагментом. содержащим остатки с 21-го по 124-й ($-белок); расщепленный фермент сохраняет активность. После отделения 5-пептпда от 5-белка путем фракционирования при кислом рН нн $-пептпд, ни $-белок не обнаруживают активности. Если же смешать 3-пептпд и Я-белок при рН 7,0, то они образуют активный комплекс — РНазу-5. 5-Пепт1гд связывается с 5-белком пе дисульфиднымп связями, а благодаря сильным нековалентным взаимодействиям.
Рассмотренные данные отражены на приводимой ниже схеме; в кружке показаны остатки гистидина-12 и гнстпдпна-! 19: ьг гз з.кека|ад а иелеа~з ~ + РН 9 0-белок 119 РН а за Ряаза Синтетический пептид, идентичный по последовательности фрагменту Б-пептпда, содержащему остатки с 1-го по 13-й, способен взаимодействовать с 8-белком; при этом восстанавливается 701)а активности РНазы-Ь; однако пептид, являющийся более коротким фрагментом Ь-пептида (остатки с 1-го по 11-й), не вос- 9.
ФЕРМЕНТЫ. 11 З р л рС) ою М~Ф р О р СЧ р р4 Х р а~ оФ х р сч Н а6 р.о рО о й в О1 д д .О м о рр р Ь П О о р р р о с х М о д й с4 э' Оъ ы о 3й ~О 'О ~Ъ Ф 20' и. клтллиз зов ьсм. ны-мэ-пнаае 3-оп~-и»ь-12-гнвьа Анализ показал, что в 3-Сщ-НЬ-12-РНазе НЬ-12 карбоксиметп- лирован по атому азота в положении 3, а в 1-Сщ-НЬ-119-РНазе Н!з-119- — по атому азота в положении 1.
ын — снх — сн-соок ! Ю Ю ноос-сн — »ч ы вккарааксимевиягиап~маии хн, ! ~= — Г-сн,— сн-соон н%. ы — сна — ооон М'-квраоксиметпилгистпявмн станавливает активности. Эти данные показывают, что чибо НЬ-!2, либо Яе1-13, либо оба этн остатка играют ключевую роль в РНазиой активности, в то же время остатки с 14-го по 20-й непосредственно не участвуют в формировании активного центра. Получены данные о важной роли ряда других остатков для активности фермента.
Пепспн расщепляет пептидную связь между 120-м н 121-м остатками; фермент, лишенный остатков 121 — 124, оказывается неактивным. Если отшспить карбоксипептпдазой Л от 5-белка 1'а1-124, то после рекомбинации с 5-пептидом активность РНазы-5 полностью восстанавливается; прн удалении 5ег-123 и последующей рекомбинации активность снижается на 55%; прп более глубоком действии карбоксипептидазы А, приводящем и отщеплению нескольких следующих остатков, включая Рйе-!20, наступает полная инактивация. О важности для активности фермента Н!з-12 и его функционировании в активном центре фермента свидетельствуют результаты карбокснметилпрования РНазы нодацетатом (ИА) прн рН 5,5, т. е. в условиях, при которых преимущественно происходит карбоксиметилированпе гистидина.
Степень инактивацип РНазы оказывается пропорциональной степени карбокспметилпрованпя; полностью лишенный активности фермент содержит только одну карбокспметнльную группу (на молекулу РНазы). При ионообмеиной хроматографии карбоксиметнлированиой РНазы обнаруживают две химически различные формы фермента; одна из них (выход -15%) названа 1-Сгп-НЬ-119-РНазой (Ст=карбоксиметнл), а другая (выход 85%) 3-Сгп-НЬ-12-РНазой. Обе формы являются неактивнымп; при этом важно отметить, что ни одна из форм не содержит двух модифицированных остатков гистпдина. Различие структуры обеих форм схематически изображено ниже: к Феейигиты и Следует отметить, что прн дальнейшем действии ИЛ на обе монокарбоксвметплированные формы РНазы алкнлирования незамещенного гистидииа не происходит.
Эти данные показывают, что остатки гнстнднна выступают как нуклеофплы, вытесняя реакцпонноспособиый атом иола ИЛ, что приводит к образованию карбокснметилированных производных гпстиднна. Полученные данные позволяли также предполагать, что Н!з-12 и Н!з-119 сближены в активном центре, прп этом 11!з-119 способствует алкплпрованшо Н!э-12, а Н!з-12 — алкилированию Н1з-119. Нгй-пэ НЫ-1г 1-См Итй-11Э й 1!н + сн снй !+ ! м Фс ы -о ьнч „м йа — и ны-1ГВ НЫ-1г з-с -ны-ж Таким образом, алкнлнровапие осуществляется благодаря надлежащей ориентации гистндинов, соответствующему расстоянию между ними, а также вследствпе электростатического взаимодействия между заряженными имидазольнымп группами и карбоксплатной группой ИА. То обстоятельство, что Н1а-119 алкнлпруется в большей степени, чем Н!з-12, свидетельствует о более высоком значении рК имндазольной группы Н!з-12 и о том, что прп рН 5,5 он находится почти полностью в протонированной форме.
В пота с 12 ею ьз айсц нйй йЮЮОйййййй 67уй 10 мйй зрз и катализ ины, эу, вееры", с ыыи снн саряезаЗЗ ные сзяеи ~''" с=о оРис. 9.8. Строение рибонуклеазы $. Показано взаиморасположение Н1з-12, НЬ-!19 и Ьуз-41 в активном центре, а также четыре дисульфндные связи. (оралае Т Е., ГР(Пор Вя Вепалг У., Ра1саотлой А, Абт.
Рто1е1п Сйепь, 24, 239, 1970.1 следующих исследованиях показано, что рК для НЬ-12 и НЬ-! 19 равны 5,2 и 5,8 соответственно, при связывании же ингибитора они повышаются до 8,0 и 7,4. При лиофилизации фермента из 50%-ной уксусной кислоты образуются димеры, обладающие полной активностью.
При смешивании равных количеств неактивных 1-Сгп-Н!э-119-РНазы и 3-Сгп-НЬ-12-РНазы и лиофилизации из уксусной кислоты также образуются димеры. Более примечательным является то обстоятельство, что ~~4 димеров алкилированных форм проявляет активность, соответствующую 50%-ной активности немодпфицированных димеров, Активность таких димеров утрачивается прп их днссоциации в результате нагревания при 67'С в течение 1О мин. Объяснение этих данных приведено на схеме (с. 309).
При растворении карбоксиметилированной РНазы в 50%-ной уксусной кислоте нековалснтные связи между ХНз-концевым участком (остатки с 1-го по 20-й) и остальной частью полипептидной цепи разрываются подобно тому, как это происходит при отделении 8-пептнда от 5-белка при диссоциация в кислой среде. При лиофилизации 5-пептидные области двух различных молекул эффективно взаимодействуют с соответствующими областями 5-белков, образуя димеры, как показано на схеме; из трех типов образующихся димеров два оказываются неактивными, поскольку в каждом из сформированных активных центров оказывается алкилированным либо Н!з-1!9, .пибо Н(з-12; в то же время в днмерах третьего типа формируются один продуктивный активный центр (не включаюгций остаток алкплированных гистидинов), а другой неактивный, содержащий 1-Сгп-Н!6-119 и З-Стп-Н(6-12.
Определены пространственные структуры РНазы и РНазы-5; оказалось, что онн отличаются только в области, в которой в РНазе-8 расщеплена пептидная связь. Как видно из рис. 9.8, молекула имеет форму почки с выраженным углублением на одной стороне, в котором локализуются Н(з-12 и Н16-119 — остатки, которые на основании данных, полученных с помощью химической Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
