Osnovy_biokhimii_Uayt_tom_1 (1123309), страница 58
Текст из файла (страница 58)
и истидина. Ряд фторфосфатов ннактивирует фермент; например, диизопропилфторфосфат (ДИФФ) стехиометрически реагирует с ферментом, образуя диизопропилфосфорилхимотрипсни (ДИФ- химотрипснн): О ,,снз е — он Фр — р — о — сн О СНз О сн, Š— Π— Р— Π— СЙ +Р +Н+ 'сн, Винзапропмлфсппрфвофвп! дяф-хнпсо!припсин ынзе 1 О (снз), О нас ~ з--мн — с — с — сн,— С1 1 д-д.~и-нонд н-сд ионна) амидозы феинпамннмирмамнинмнон ЫБ-анино" ец -и оиамсдиахамни!- амндопенмиипнорме~пнпнемон ДИФ-химотрипсин совершен!ю не активен. Поскольку из 28 остатков серпна с реагентом взаимодействует только одни остаток (серии-198), а утративший активность в результате тепловой денатурацин химотрипсин вообще не модифицируется реагентом, сделано заключение, что серии-195 находится в активном центре.
Все так называемые сериновые протеиназы (табл. 6.4), образующие промежуточные ковалентные соединения (ацнлферменты), также реагируют с ДИФФ; анализ последовательности аминокислот в ипактивнрованных с помощью ДИФФ ферментах показал, что остаток реактивного серина находится во фрагменте, имеющем у всех этих ферментов идентичную (или очень сходную) последовательность. Одна и та же последовательность Яу — Азр— Бег.Р— О(у — 01у — Рго имеется в химотрипсине, трипсине, эластазс, тромбине и плазмине, однако у субтилизина последовательность аминокислот, включающая реактивный остаток серина„другая. Высокая реакционная способность модифицируемых остатков сорина является следствисм нх уникального окружения в активных центрах соответствующих ферментов.
Прн действии на химотрипсин с-1- (а-толуолсульфоннл) амндо- 2-фенилэтилхлорметилкетоном (ТФХК) также наблюдается включение ковалентно связываюшегося ингибитора (параллельно происходит снижение активности) и. ккттлнз Структура ТФХК отвечает требованиям, предъявляемым к хорошему субстрату, и напоминает амид или зфнр ацетнлфенплаланина, у которых — 5(Н» или — ОСН» заменены негндролпзуемой группой — СН» — С1. Энергия свнзывания ТФХК (его сродство к активному центру) примерно такая же, как у субстрата, однако вследствие высокой реакционноспособности группы О=С вЂ” СН»С! реагирует с нуклеофнлом в активном центре. Структурные исследования показывают, что ТФХК реагирует с азотом, находящимся в положении 3 импдазольного кольца гистнднна-57: ы.=! Е-СН.
~ -!- К вЂ” С вЂ” СН.— С! — + Š— СН.— ) м 1! Ё + е +С! +Н -!чн !ч — сн» вЂ” с- к где К=1-(!!-толуолсульфонил)амида-2-фенплзтнл. У хпмотрипснна (а также у трипсппа, тромбнна и эластазы) Н(з-57 находится в последовательности Л!а — А1а — Н(з †С. На избирательную специфичность ТФХК к химатрипсину указывает тот факт, что пнгнбптор не реагирует с другой сершювой пратепназой — трппспном, однако трипснн реагирует со сходным ннгибптором !=5-амина-1-(и-талуолсульфонпл)амидопентилхлорметнлкетоном (ТАХК), в структуре которого имеется боковая цепь — (СН») 4 — ХНа, необходимая для продуктивного связывания с активным центром трипспна, ТАХЕ модифицирует специфический остаток гпстндина в трипсине, но не ннактивирует химотрипсин.
Обработка фермента ТФХК илп ТАХК является примером аффинной модифика!(ии активного центра, а сами ингибиторы— аффинными летками, нли, образно говоря, ингнбиторамн типа «троянского коня». Аффинные метки известны также для ряда других ферментов; они особенно полезны для идентификации остатков, находящихся в активном центре. Известна последовательность (рис. 9.2) и пространственная структура а-хнмотрппсина п его зимогена — -химотрипснногена; частично сформированный в зимогене активный центр, не способный осуществлять катализ, полностью сформирован н хнмотрнпсине, образующемся при активации зпмогена (разя.
8.7.2.1). На рнс. 9.3 изображена конформацня пептндной цспп фермента; показано расположение групп активного центра. Остатки Бег-195 и Н(з-57 сближены, что согласуется с более ранними даннымп по химической модификации групп активного центра. Данные рентгеноструктурного анализа свидетельствуют также об участии ряда других функциональных групп в формировании активного центра.
1ч-Концевой нзолейцни В-цепи, который не является концевым в одиночной полипептидной цепи неактивно~о зимогена н освабож- з. ФеРменты, ц зш со-, еи зег Яу и мн; 2О В-цепь усы с1и и ч»! яу хег «у»п М чнА ча! я» зо Яи Аеп Пе Зег !у Яу Суе е АЬ Н. -и сь а в» А1» г Ьу» АФС1» !еи зег а! 50 Ап бо Я Че! ТЬ»ТЬ»5е»АЧ жг аг Ча! Ыу ЧМ Ч»1 Ы АЬ ВО Ке Ьу» и уа 1» Пе еу»СЫ зв.
Ыг г !у !п Ье 70 А!» и 1у АЬ Яу нн 90 Ьуе аг 5 у» Туг 100 1.1 ЧЮ 5»г Геи г Ие Аеп А»п 110 зе Ье зи. и А!а и зег !.еи 1.уе 1.еи 120 суг а! А1а зег ч»1 ть» см се и со '3 У АЬ Аеп Ь 150 170 ты Яу гу у у» уе Суг Ьуч 7 ВО Ое уе А»П А!а М и 200 а1 »гешу ухе» с-цвъ Ры Аер гз еи 1п яп А1» ыг 01у Сеи Ь 1»у 140 !у тЬ еи Аеп Ьг Ы» 1.еи ! еи га 150 А!а ч»1 Ь А !у ТГч ТЬ у» 5-5 СМ !.у» АЬ ау Ыа Ыг С!у Ч»1 Бл Аье 1ЗО Яу 1 ! ° зе 5.
220 у 5»г Тпг Ыг Ьуе Яу 2!О ич,! Яу ве и А1а Г 1 зег 1у ССге еп А!а Аь ьеи ть» и 01п Уа1 гУ 240 ча1 »и АЬ ТЬ Ч»1 »ХА!а у 2зо дается в результате активации, приводяшей к образованию активного фермента, оказывается сближенным с Азр-194. Как показано на рис. 9.4, а-амнногруппа Пе-16 образует ионную пару с карбоксилатной группой боковой цепи Аар-194. Гидроксидная группа 5ег-!95 расположена на расстоянии 3 А от атома азота, находящегося в положении 3 нмидазольного кольца Н1з-57. Расстояние между гидроксидной группой серина и атомом азота имидазола н Рвс. 9,2. Аминоккслотнвя последовательность а-химотрипсииа. Звтемнеш!ые оствтки входят в цвело тех, которые соли!вены в нвтнвном ферменте, образуя активный центр.
1В1овг 77. М., р. 188, !и: Р. Воуег еб., Т1!е Епхутнез, чо1. Ш, Асабып10 Ргезз., Опс., Иегч 1ог11, 197Ц 392 и. кхтллиз геометрия их взаимного расположения позволяют образоваться между ними водородной связи. Далее, атом азота в положении 1 нмидазольного кольца находится на расстоянии 2,8 А от атома кислорода карбоксилатной группы боковой цепи Азр-102; в этом случае геометрия взаиморасположения также благоприятна для образования водородной связи. Наконец, водородная связь образуется между одним цз атомов карбоксилатной группы Азр-102 и — МН-группой пептидной связи, находицейся между Н)з-57 и А!а-56. Три рассматриваемые остатка Азр-194, бег-195 и Азр-102 образуют систему переноса заряда, которая, как полагают, с одной стороны, позволяет Н!з-57 функционировать в качестве сильного кислотно-основного катализатора, а с другой стороны, способствуя оттягиванию протона от — ОН-группы 5ег-195, увеличивает ее реакционноспособность.
Сравнение кристаллических структур а-химотрипсина в присутствии и в отсутствие Ы-формилтриптофаиа 1который называют виртуальною субстрато!и, поскольку кислород его карбоксильной группы обменивается с кислородом воды в присутствии хнмотрип- Рис. 9.3. Коиформзция пептидных цепей а-химотрипсннз 1а) и злвстззы 1б). Перегибы цепи соответствуют положениям а-углеродиых атомов; К-труппы не понвззны. 11!аг!1еу В и., Бпо!!еп Ю. тг!., р. 323. !и.' Р.
Воуег, еб., ТЛе Епзыпез, чо1. 1П, Асвбе!п)с Ргезз, 1пс„!тете Уогх, 19УЦ з. Ферменты. и О!у-19з ппа Ряс. 9.4. Салема перекоса заряда а активном центре химотрипсииа )по даиимм реитгеиоструктурного анализа) . )В!оса В. М., р. 18о, !п: Р. Воуег, ег)., Тпе Епхугпез, ъо1. 1!1, Асаоепз!с Ргезз, Опс., Хеъ Уог)с, 197Ц сина) раскрывает некоторые дополнительные детали строения активного центра. Н СНз — С вЂ” СОО" Х Н сг-н -фар мил-ОмрипгяаЕаи Как показано на рис.
9.5, М-формг!лтриптофан внедряется в «полость» активного центра и располагается очень близко от системы переноса заряда, с которой контактирует его карбокспльная группа. Индольная группа направлена в противоположную сторону, ее плоское кольцо располагается почти параллельно полипептидной цепи, проходящей вдоль обоих сторон кольца, и имеет гидрофобные контакты с некоторыми К-группами, в первую очередь с К-группой остатка Ме1-192. Лмндная группа формилтриптофапа направлена в сторону — СО-груг!пы пептндной связи, образованной остатком Бег-2)4. Рассмотренные нековалентные взаимодействия, обеспечивают связывание субстрата, определяют специфичность химотрипсина и вносят вклад в увеличение скорости катализнруемой реакции. и.
катализ Рнс. 9.5. Структуры активных центров а-химотрипсина (сверху) и зластазы 1сннзу), основанные иа данных кристаллографпческаго анализа; показано расположение виртуальных субстратов 11-формилтриптофана 1для а-хнмотрипсина) и 1)-фор. милалзиниз гдля зластазы). [Нагйеу В. Я., Яйойел В. М., р. 323„1п: Р. Воуег, ег)., ТЬе Епзугпез, та1. 111, Асаг)епп1с Ргезз, Опс., Хетт Уог1с, 197Ц з. Ферменты н Вероятный механизм функционирования хпмотрипснна, основывающийся на приведенных выше даняых, показан иа рпс. 9.6. Очевидно, что для решения вопроса, справедлив ли этг>т механизм, необходимы дальнейшие исследования. Однако этот механизм достаточно хорошо согласуется со всей доступной в настояшее время информацией.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
