Лекции Рубина (1123233), страница 18

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 18)

В отличие от белков структура ДНК более стабильна. Тепловыефлуктуации не приводят к разрыву водородных связей и не меняют меж­плоскостные расстояния между основаниями. В моделях жесткость слу­жит основным параметром.жесткостьюподлинеДвойная спираль ДНК обладаетспиралииодновременноограниченнымобщейчисломвращательных степеней свободы вокруг единичных химических связей.Все конформации ДНК относятся либо к Ачае В-- , либок В-формам. В слу­форм ось спирали проходит через пары оснований вблизи ихцентра тяжести, а в А-форме в центре остается отверстие около4Е, аоснования оттеснены к периферии молекулы. Основная трудность пол­ного описания энергетически разрешенных конформаций двойных спи­ралейсостоитвчрезвычайнобольшомнаборевсехструктурныхвариантов.Конформация мономера нуклеиновой кислоты задается конформа­цией сахарного кольца, пятью двугранными углами вращения вокругединичных связей в сахарофосфатной цепи и одним углом х, опреде­ляющим ориентацию основания относительно сахарного кольца.

Разли­чие А-иВ-форм состоит в том, что у А-формы отличаются значенияСЗ-эндоСЗ-эк.зо5N5зС2-экзоС2-эндоNз2.Рис.8.7.Формы спирали ДНК: четыре наиболее устойчивые конфор­мации сахарного кольца в нуклеотиде98углах и угла поворота 't между соседними парами, а также большие зна­чения расстоянияDпары от оси спирали (рис.нативная геометрия сахарного кольца у А-8.7).и В-Кроме того, альтер­форм определяетсятем, какой из атомов углерода выдвинут из плоскости сахарного кольца.Наличие столь большого числа внутренних степеней свободы позволяетрассматривать процесс изменения конформации двойной спирали какнепрерывный.

Однако можно ограничиться лишь "разумными" взаимо­положениями пар оснований. Тогда оказывается, что для регулярнойспирали сушествует только ограниченное число конформаций сахаро­фосфатного остова. Расчеты показывают, что энергия Авыше, а ширина энергетической ямы уже, чем у В--форм в целомформ. Это являетсяследствием того, что расстояние между одноименно заряженными фос­фатами одной и той же цепи примерно наный учет всех взаимодействийlEпоказывает,короче в А- формах. Пол­что В- формаявляетсяединственной устойчивой формой ДНК.В последние годы получены данные о сушествовании так называе­мойz-формы ДНК, в которой спираль с антипараллельными нитямизакручена влево, а повторяющаяся единица содержит не один, а два нук­леотида.99Лекция9.ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНАЯДИНАМИКА БЕЛКОВЗависимость функциональных свойств белков от их конформаци­онного состояния давно известна в биохимии.

Однако остается неясным,под влиянием каких сил и механизмов изменяется это состояние и какуюроль оно играет в обеспечении их активности. В современной молеку­лярной биофизике центральное место занимает проблема механизма ифункциональной роли внутримолекулярной подвижности биополимеров,прежде всего белков.Решение этой проблемы предусматривает получение количествен­ных характеристик подвижности отдельных частей и атомных групп исопоставление их с функциональным состоянием молекулы белка приразличных условиях (температура, рН, ионная сила).

Поскольку белокобладает гетерогенной пространственной организацией, подвижностьего отдельных структурных единиц будет различной по своим характер­ным временам и амплитудам смещений. Кроме того, глубокие конфор­мационные перестройки всей молекулы белка не могут происходитьсразу, а складываются из локальных микроинформационных смещенийотдельных атомных групп.

В итоге они приводят уже к направленнымперестройкам всей конструкции молекулы белка вследствие взаимногосмещения его отдельных частей по определеннымдетерминистскимстепеням свободы. Приведем в качестве примера последовательных,функционально значимых перестроек в белке конформационные изменения гемоглобина (НЬ). Присоединение кислорода к атому железаприводит к смещению его на+2Fe0,7 А в плоскость гемовой группы.

Этопервичное микроинформационное смещение индуцирует в НЬ каскадпоследовательных перестроек. Они включают смещение гистидина кцентру молекулы, смещение субъединиц с перестройкой системы водо­родных связей. При этом меняется и конформация самих а- и13--субъединиц.

После оксигенации первых двух а-субъединиц облегчаетсяприсоединение следующих молекул кислорода к остальным субъедини­цам, сродство которых к кислороду увеличивается в несколько сот раз. Вэтом и состоит функционально направленный смысл кооперативныхконформационных перестроек в НЬ. Физическая причина их состоит втом, что первоначальное равновесие сил необратимо нарушается в ре­зультате акта присоединения кислорода к Fe+. В молекуле НЬ должнаустановиться новая равновесная оксиконформация, которой уже соот­ветствует другое взаимное расположение атомных групп.

Процесс дос­тижения этой конечной.равновесной оксиконформациипроисходитчерез ряд последовательных стадий как релаксация исходной дезокси­формы, ставшей неравновесной из-за быстрого присоединения кислоро-100да. Непосредственное изучение быстрых внутренних движений в моле­куле белка стало возможным лишь в последние годы, благодаря внедре­ниюсовременныхфизическихрезонансныхметодоврадиоспектроскопии (электронный парамагнитный, ядерный магнит­ный, ядерный гамма-резонансы, методы люминесценции). Остановимсякратко на физической сущности этих методов и получаемой с их помо­щью информации.Основной экспериментальный подход состоит в том, чтобы, изучаяопределенные физические параметры (люминесцентные, парамагнит­ные) специально внедренных во внутрь белка низкомолекулярных со­единений, получить характеристику подвижности окружающей их среды,т.

е. характеристику внутримолекулярной подвижности белка.Люминесцен1Ные методы позволяют измерять внутримолекулярнуюподвижность белка, изучая, как зависит от температуры положение мак­симума люминесценции введенной в белок метки максимума либо соб­ственной люминесценции триптофана белка. При поглощении квантасвета люминесцирующей молекулой один из двух п-электронов перехо­дит на возбужденный синглетный уровеньS1(рис.9.1),а вся молекулапри этом переходит в синглетное возбужденное состояние. При переходев возбужденное состояние запас колебательной энергии молекулы кратковременно повышается, а затем за время10-11- 10-12с происходит дис-сипация колебательной энергии и релаксация на нижние колебательныеподуровни того же самого электронного состояния•*состоянии S1 молекула живет=10-8вновь вернуться на основной уровеньS1.

В возбужденном910- с, после чего она может-Soлибо с испусканием квантафлуоресценции, либо безызлучательно, рассеивая в тепло энергию элек­тронного возбуждения. За времяэлектронаизменитьнауровнесвоюS1ориентациюнет параллельным спину оставше­-ранееспаренногосуществования состоянияS1спиннапротивоположную. Тогда он ста­гося•*можетсs1нимп электрона. В этом случае проис­ходитпереходплетноемолекулысостояниевтри­~ Т,S1вкотором спины электронов на Srги(рис.Т-уровнях9.1).состояниетребуетПереходТ~Soпараллельнывосновноетеперьпереориентациитакжеспиноввновь на антипараллельную. По­этому вероятность Т ~Soперехо­да мала, а время жизни состоянияТ велико по сравнению с состоя­2нием S1 и составляет 1о- 6 - 10- с иРис.9.1.Схема переходов междусинглетными(s 1, s0)и триплетными(Т) СОСТОЯНИЯМИ молекулы.101больше.

С триплетного уровня молекула переходит на основной с испус­канием света фосфоресценции. При нахождении в возбужденном со­стоянииS1илиТ в молекуле изменяется электрический дипольныймомент, влияющий на диполи окружающей среды. За время жизни моле­кулы в возбужденном состоянии диполи среды могут успеть переориен­тироватьсявсоответствиисполемвозбужденногодиполя.Этопроизойдет, если время дипольной релаксации окружающей среды <рмного меньше времени•*возбужденного состояния ( 'tp <<•*). Тогда соот­ветственно будет понижен энергетический уровень возбужденной моле­кулы,амаксимумееспектрафлуоресценциисдвинетсявдлинноволновую область.

Если же <р >><*, то переориентация диполейсреды не успеет произойти, т. е. в этом случае окружение флуоресци­рующей молекулы жесткое и не влияет на положение максимума полосыее флуоресценции. Ценную информацию о внутримолекулярной под­вижности белков получают, изучая таким путем собственную флуорес­ценцию триптофана. Положение максимума его флуоресценции сильнозависит от подвижности диполей среды и может варьировать до30нм. Всложной системе белка время реорганизации окружающей триптофансреды может быть больше времени его электронного(•*~5лось, что снижение температуры в диапазоне отсдвигу на4- 9S1 -возбуждениянс), особенно при низких температурах. Действительно, оказа­5 - 12 нм,а в диапазоне температур от0° до - 20°-20° до -90°приводит кк сдвигу нанм положения максимума флуоресценции триптофана в коротко­волновую сторону спектра.

Это говорит о замораживании движений вбелковой матрице в наносекундной области. Высушенные белки неРис.9.2. Расщепление энергетических уровней электрона (протона)магнитном поле (Н).102вдают этих спектральных сдвигов, что свидетельствует о необходимостиприсутствия в структуре белка воды для обеспечения его подвижности.Система белок-вода замерзает как единая микрофаза. Если вводить вбелок экзогенные фосфоресцирующие метки (например, производныеэозина), то таким способом можно оценивать более длинные характер­ные времена структурных перестроек (до1 с).Оказалось, что в глубокихслоях белковых макромолекул происходят медленные движения <р ~1 с,а в более поверхностных слоях эти движения существенно быстрее:3<р ~ 10- с.

Надо ясно понимать, что найденные времена характеризуютподвижность только ближайшего микроокружения люминесцирующегохромофора и не могут распространяться на всю макромолекулу. Число иместа локализации таких люминесцирующих меток в белке зависят их отхимических особенностей и от характера взаимодействия с белковымигруппами.Методы радиоспектроскопии включают главным образом методэлектронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и ядерного магнитногорезонанса (ЯМР). Физические основы этих методов достаточно сложныи подробно изложены в специальных руководствах и учебниках. Здесьмы кратко остановимся лишь на тех вопросах, которые необходимы дляпонимания их применения в биофизике. Как электроны, так и ядра ато­мов обладают собственным магнитным моментом, или спином.

Еслисистему таких спинов поместить в постоянное внешнее магнитное полеН0 , то спины будут ориентироваться вдоль поля. Энергетический уро-вень расщепится на два уровня. Энергия электрона со спином S = l2будет теперь зависеть от того, параллельно (верхний уровень) или антипараллельно (нижний уровень) направлению поляспины (рис.(спин1/29.2).Н0расположеныСоответственно нижний уровень займут ядра протонас антипараллельным, а верхний уровеньполю Н0 направлением спинов (рис.-с параллельным9.2).Разность энергетических уровней составляет величину(9.1)В формуле (9.1) g постоянная величина, так называемыйg - фактор электрона или ядра, который для свободного электрона равен2,0023, а для ядра протона - 5,58.

Величина 13 - магнетон Бора, равный24для электрона~ 10-21 эрг/Гс, или ядерный магнетон IЗN = 5· 10- эрг/Гс.На нижнем уровне Е1 заселенность (Nl) частиц больше, чем на верхнем(N2), причем, отношение заселенностей зависит от разности энергийЛЕ=Е2 - Е1:103N1 = eg~Ho/ksTN2=eлE/ksT(9.2)Наложим теперь на эту систему помимо постоянногоменное магнитное поле с частотойv,Н0пере­перпендикулярное постоянномуполю. Тогда в системе будут индуцироваться вынужденные переходымежду двумя уровнями: N1 ~ N2 и N2 ~ N1. Но поскольку исходноN1 > N2 , то число переходов с нижнего уровня на верхний N1 ~ N 2 превы­сит число обратных переходов.

Характеристики

Список файлов лекций