Лекции Рубина (1123233), страница 19
Текст из файла (страница 19)
М ~ М. В результате будет происходитьрезонансное поглощение энергии переменного поля при условииhvg /3 Но.=(9.3)При величине внешнего полян0-410 Гс резонансная частота для1свободного электрона равна Ve = 2,8· 10 с- , а для протонного ядерного71резонанса она намного меньше: vн= 2,26·10 с- • На рис. 9.3 изображены=10линия поглощения переменного поля и ее первая производная (сигналЭПР) в зависимости от величины постоянного магнитного поля Но.Обычно устанавливают постоянную частотуvпеременного поля, а затемплавно меняют внешнее постоянное поле до достижения тех. значенийНо, при которых наблюдается резонансное поглощениеКак видно из рис.9.3,(9.3).сигнал ЭПР обладает не узкой линией, а полосой поглощения с определенной шириной.
Это значит, что на самомделе сами энергетические уровни спиновогосостояниянесколькоразмыты, т. е. обладают определенной шириной Г. Основная причина этогоСОСТОИТвдействиетом,сЧТОвзаимо-внешнимимаг-анитными полями не являетсяединственнымпроцессомобмена энергиейв системеориентированныхспинов.Она не изолирована, а взаимодействует также и с окружающейсвоюсредой,энергиювременемТ~.препятствуетн6передаваясосреднимЭтотпроцессвыравниваниюзаселенностей Мни М поддействием переменного поля.Существуютцессыиобменадругиепроэнергиейвсамой системе спинов, которые влияют друг на друга104иРис.9.3.Линия поглощения СВЧ-поля (а) и ее первая производная (б)изменяют энергии спиновых состояний.
Спин-спиновые взаимодействиясоздают дополнительные локальные магнитные поля в местах расположения соседних спинов и тем самым меняют строгое условие резонанса(9.3),уширяя общую линию поглощения. Процессам спин-спиновоговзаимодействия соответствует время Т2 , в течение которого сохраняетсяотносительная энергия данного спинового состояния.
Очевидно, времяТ2 сохранения спинового состояния тем больше, чем меньше спинспиновое взаимодействие. Описанные релаксационные процессы распада исходных спиновых состояний приводят к тому, что положение энергетическогоуровняспиновстановитсянескольконеопределеннымихарактеризуется шириной Г.В квантовой механике связь между временем 't существования данного состояния и шириной Г его точного энергетического уровня (Ео)дается соотношением неопределенностей для энергии(9.4)гдеn-постоянная Планкаh,деленная на 2п( n = h/2n).Таким образом, истинное положение энергетического уровня (Ео) состояния электрона в системе с временем релаксации Т1 может быть определено поположению линии резонанса с ТОЧНОСТЬЮ ДО n/Т..
( Ео ±;).При ~'t00ширина Г ~ О и энергия Ео находится точно. В общем случае шириналинии резонанса определяется какЛН:::::,.-1-+_!_2Т..(9.5)т;_Для свободных радикалов Т1>> Т2и ширина линии ЭПР зависит вОСНОВНОМ ОТ времени Т2:1лн~-т;_(9.6)Нас интересует вопрос, каким образом связана ширина с характером внутримолекулярной динамики в исследуемом образце? Если вязкость в образце мала, то за счет быстрых молекулярных движенийвзаимные влияния спинов успевают усредниться при поглощении переменного поля. В этом случае резонанс наблюдается при усредненнойлинии с уменьшенной шириной.
Наоборот, замораживание раствора иуменьшение его вязкости вновь замедлят молекулярные движения. Тогдапри поглощении энергии переменного поля спины успевают почувствовать влияние разных локальных полей в своем микроокружении, что105уменьшит время Т2 сохранения спинового состояния и вызовет уширениеобщей линии резонанса. Таким образом, измеряя ширину линии поглощения, можно получить данные оженийвмикроокружениихарактере внутримолекулярных двиспиновойчастицы(радикал,протон).Вметоде спиновых меток к функциональной группе белка присоединяютсвободный радикал, дающий сигнал ЭПР.
Характеристики сигнала ЭПРявляютсяпоказателемподвижностимикроокруженияэтогорадикала.Наиболее удобны нитроксильные метки, содержащие свободнорадикальную группу N -6 , гдеван между атомамиNнеспаренный электрон фактически делокализои О. Сигнал ЭПР этой метки имеет определеннуюструктуру, которая обусловлена влияниеммагнитного момента ядраазота на неспаренный электрон наряду с действием на него внешнегомагнитногополя.Вращениенитроксильногорадикалаотносительнонаправления внешнего поля изменяет структуру сигнала ЭПР.
Существуют методы расчета, которые позволяют по параметрам сигнала ЭПРоценить характерное время 'te вращения метки. Оказалось, что времявращения метки зависит от глубины ее погружения в слоях белковойглобулы. В наружном водном слое значения 'te составляют 10- - 10- с.10Поверхностные слои характеризуются значениями 'te ~ 10- - 10-8 с и,1110наконец, в глубоких слоях плотного гидрофобного ядра глобулы 'te ~ ю8 -10-7 с. Бьшо обнаружено также резкое увеличение ферментативнойактивности высушенных препаратов реакционных центров фотосинтезаприих увлажнении,котороекоррелируетсодновременнымпадениемзначений 'te спин-метки. Это говорит об изменении динамического состояния и одновременном появлении внутримолекулярной подвижностии функциональной активности белка.Метод ЯМР.
Изучение динамики белковых структур методом ЯМРосновано на измерении времени релаксации Т1 и Т2 по ширине линиирезонанса. На основе этих данных удается найти значения 'te для ядер, накоторых наблюдается резонанс.Изучая протонный резонанс, можно в принципе оценить подвижность белковых групп, в состав которых входят "резонирующие" протоны.МетодЯМРпозволяетизучатьопределенныевидывнутримолекулярного движения в белках. Так, температурные измерениявремени Т1 в сывороточном альбумине обнаруживают вращения метильных групп с временами 'te ~ 10- 10 с при - 100° наблюдаются более медленные движения 'te ~ 10-8 с (возможно, осцилляции полипептиднойцепи).
По времени Т2 для протонного резонанса удается определить трихарактерных диапазона времен 'te: медленное вращение глобулы как целого ("Се~ 10-5 с), внутренние движения ("Се~ 10-5 - 10-6 с), движение10внешних наиболее подвижных групп белка ( 'te ~ 10- с). Метод ЯМР даетважную информацию и о химической структуре молекулы. Она проявляется в результате разного влияния локальных полей соседних ядер наположение полосы резонанса отдельных протонов, занимающих различные места в структуре молекулы. Вследствие этого у разных протонов106резонанс появляется на разных частотах. Это явление называется химическим сдвигом.
Кроме того, структура полосы ЯМР так же, как и в случае ЭПР, отражает тонкие эффекты влияния магнитных моментов ядер,передающиеся через электронные связи в молекуле.ЗJ=В,70 Гц...J='J.~OГu,Э1~'1=456 ГцrnРис.9.4.соо3Спектр ЯМР ацетальдегида СНзСНО. Магнитное поле увеличивается слева направо.На рис.9.41-величина сверхтонкого расщепленияприведен спектр протонного резонанса ацетальдегидаСНз-СНО.
Видны две группы линий от трех протонов метильной и отодного протона альдегидной химических групп в молекуле. Эти двегруппы разделены химическим сдвигом. Кроме того, видно расщеплениекаждой из групп на отдельные линии вследствие влияния друг на другамагнитных моментов соседних ядер. Следует заметить, что подобнаярасшифровка спектров ЯМР от белковых молекул затрудняется их сложным характером и перекрыванием основной массы резонансных линийот протонов.также нас еичасIЗС ,широко используются данные по резонансу налинии которогонаходятся встороне от-основноиЗlр,амассыперекрывающихся линий.Метод ядерной гамма-резонансной (ЯГР) спектроскопии даетважную информацию о динамике белков.
В отличие от методов ЭПР иЯМР он дает не только временные, но и амплитудные характеристикидвижений в белке. Метод позволяет определять средние величины смещений атомов в ст~уктуре белка, которые происходят в течение короткихвремен 10-7-10-с. Метод основан на резонансном поглощенииs1F е, которыисодержится в природных соединениях в количестве 2,2%. Энергия57у-кванта, поглощенного ядром изотопа Fe, составляет ЛЕ = 0,0144 мэВ,у- квантов тяжелым ядром атома, например ядром изотопа10757а время жизни ядра•* ~ 10-Fe в возбужденном состояниипользуясь соотношением неопределенностей для энергиичтоестественнаяшириналиниипоглощения7с.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
