obshaya_tsitologia (1120994), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Так же как в световом микроскопе, объективная линзаопределяет его основные показатели. Первичное изображение увеличиваетсяпроекционной линзой и проецируется на экран, покрытый люминесцентнымслоем, светящимся при попадании на него электронов. Вместо светящегосяэкрана изображение можно поместить на фотопластинку и получить снимок.Напряжение, которое используется для ускорения электронов в большинствепросвечивающих (трансмиссионных) электронных микроскопов, достигает 50150 кВ.
При напряжении в 50 кВ электрон обладает длиной волны в 0,05 А, и вэтом случае теоретически можно было бы получить разрешение в 0,025 А (d ~0,5 λ). Однако в современных конструкциях электронных микроскоповдостигается разрешение около 1 А из-занедостаточной стабильностинапряжения, стабильности тока линз, неоднородности металла магнитных линзи других несовершенств прибора (теоретически возможно еще повыситьразрешение электронного микроскопа в 100 раз). Но и достигнутое разрешениеогромно (вспомним, что величина О-Н связи в молекуле воды равна 0,99 А):оно сейчас уже в 106 раз выше разрешающей способности глаза!На экранах и фотопластинках электронных микроскопов можно получитьувеличение до 50 000 раз, в дальнейшем при фотопечати можно получить еще10-кратное увеличение, так что конечное увеличение, при котором максимально46реализуется разрешение, может достигать 106 раз (например, если 1 ммувеличить в 106 раз, то он достигнет длины в 1 км).Внастоящеевремяэлектронно-микроскопическоеизображениесфлуоресцирующего экрана с помощью цифровой телекамеры передается прямов компьютер, где на экране монитора его можно обрабатывать различнымобразом(изменятьувеличение,контрастностьизображения,применятьденситометрию, плани- и морфометрию отдельных компонентов).
Используяпринтер можно получить отпечатки полученных изображений.Максимальное разрешение электронного микроскопа (ЭМ) реализуетсясейчас только при исследовании металлов или кристаллических решеток. Набиологических объектах такого разрешения получить пока не удается из-занизкой контрастности объекта. Биологические объекты для исследования в ЭМпомещаются на медные сеточки, покрытые тонкими пленками – подложками(формвар,коллодий,углерод),состоящимивосновномизуглерода.Биологические объекты также в основном содержат углерод и, следовательно,мало по плотности будут отличаться от фона, будут мало контрастны. Показано,что минимальная толщина биологического объекта с плотностью около 1 г/см3,выявляемого при ускоряющем напряжении в электронном микроскопе 50 кВ,равна 50 А. Вирусы, расположенные на поддерживающей пленке, будут видны вэтом случае в виде бесструктурных пятен, а молекулы нуклеиновых кислот(толщина ДНК равна 20 А ) вообще не видны из-за низкого контраста.
Контрастбиологических объектов можно повысить, используя тяжелые металлы или ихсоли.Контрастирование корпускулярных объектовКорпускулярными объектами можно назвать частички вирусов, фагов,выделенные клеточные компоненты (рибосомы, мембраны, вакуоли и т.д.),макромолекулы.Однимизширокораспространенныхметодовконтрастированиябиологических объектов является оттенение металлами. В этом случае в47специальных вакуумных установках производится термическое испарениеметалла. При этом атомы металла разлетаются от места испарения по прямымтраекториям. Встречаясь с объектом, они осаждаются на нем в виде слоя; еготолщина будет больше в местах, перпендикулярных направлению полета частицметалла. В участках, где объект экранирует пучок частиц, возникнут «тени».Таким образом , напыленная часть объекта обладает большей плотностью, чемнапыленная подложка (фон), и поэтому объект будет виден.
Этот метод широкоприменяется не только для контрастирования вирусов, рибосом, но и длядостаточно тонких молекул нуклеиновых кислот. Минус этого метода в том, чтоон приводит к увеличению размеров объекта на толщину напыленного слоя,который в лучшем случае достигает 10-15 А. Другой недостаток его в том, чтоон дает информацию только о внешнем виде и объеме частиц. Дляконтрастирования оттенением используется платина, палладий, их сплавы, уран.При негативном контрастировании объектов растворами солей тяжелыхметаллов применяют молибденовокислый аммоний, уранилацетат, фосфорновольфрамовую кислоту (ФВК) (рис.
10). Если водные растворы таких веществсмешать с биологическими объектами, а затем их нанести на пленки-подложкии высушить, то объекты (например, вирусы или белковые комплексы) окажутсякак бы погруженными в тонкий слой аморфного вещества высокой плотности. Вэлектронном микроскопе они выглядят как светлые объекты на темном фоне(как фотонегатив). Преимущества метода в том, что растворенные соли могутпроникать в глубь объекта и выявлять дополнительные его детали. Негативноеконтрастирование широко применяется при изучении вирусов, ферментныхкомплексов мембран.
Нитчатые молекулы нуклеиновых кислот этим методомвыявляются плохо из-за их малой толщины.Соли тяжелых металлов можно использовать при так называемом позитивномконтрастировании. В этом случае контрастирующее вещество связывается соструктурой, повышает ее электронную плотность. Часто для позитивногоконтрастирования нуклеиновых кислот используют растворы уранилацетата в48спирте или в ацетоне. Уранилацетат, контрастируя нуклеиновые кислоты,хорошо прокрашивает центральные полости сферических вирусов, значительноповышает контраст рибосом и позволяет видеть тонкие нити выделенныхнуклеиновых кислот.УльтрамикротомияПри изучении объектов в электронном микроскопе возникает еще одноосложнение – это их толщина.
Дело в том, что при прохождениипучкаэлектронов через объект часть электронов поглощается, что приводит кнагреванию объекта и к его деформации. Поэтому необходимо иметь тонкиеобъекты (не выше 0,1 мкм). Другое ограничение заключается в том, что дажеесли мы будем рассматривать неизменяющиеся объекты большой толщины(около 0,5-1 мкм), что в принципе возможно (например, в мегавольтномэлектронном микроскопе, см.
ниже), то на конечном изображении будутнаслаиваться проекции структур, располагающихся на разных уровнях потолщине объекта. Тем самым изучать в трансмиссионных микроскопахвнутреннее строение целых клеток плохо и неудобно. Выход из этого положенияаналогичен тому, что было найдено для световой микроскопии, - делать срезыочень малой толщины, ультратонкие срезы (0,05-0,10 мкм).Процедура их изготовления в принципе сходна стой, что используется всветовой микроскопии. Клетки и ткани для этого сначала фиксируют. В качествефиксаторов используются буферные растворы глутарового альдегида иличетырехокиси осмия. Наиболее часто применяется двойная фиксация: сначалаглутаровыйальдегид,азатемосмий,которыйкактяжелыйметаллконтрастирует клеточные структуры.
Затем, после обезвоживания, тканипропитываются эпоксидными смолами или другими пластиками в жидкой,мономерной форме. При полимеризации таких пластмасс пропитанный имиобъект оказывается заключенным в твердые блоки, которые уже можно резатьна тонкие срезы. Здесь возникают две проблемы: где взять идеальные ножи,изъяны которых не сказывались бы при изучении клеток на почти молекулярных49уровнях, и как изготовить срезы толщиной в сотые доли микрона. Первая задачабыла решена таким образом: оказалось, что идеально острой и без зазубринрежущей поверхностью обладают сколы стекла (рис.
11). Но стеклянные ножиочень недолговечны, их используют только один раз. Применяют алмазныеножи: это специальным образом заточенные мелкие алмазы, они служат втечение нескольких лет.Проблема изготовления сверхтонкого среза была решена тоже, казалось бы,просто – это термическая подача объекта. Блок с заключенным в пластмассуобъектом крепится на металлическом стержне, который нагревается и темсамым продвигает объект вперед на определенную величину за известноевремя. И если эту термическую подачу согласовать с ритмическими цикламирезания, то можно получить серии срезов заданной толщины.
Это достигаетсяпри использовании специальных приборов – ультрамикротомов. Существуютконструкцииультрамикротомов,гдеподачаобъектаосуществляетсямеханически.Площадь получаемых ультратонких срезов обычно очень мала (0,1-1 мм2),поэтомувсеоперацииприультрамикротомированииидутподмикроскопическим контролем. Срезы, смонтированные на сетках с подложкой,необходимо дополнительно контрастировать – «окрашивать» с помощью солейтяжелых металлов. В этом случае используют также соли свинца и урана,которые связываясь с внутриклеточными структурами на срезе, позитивно ихконтрастируют.Техника изготовления ультратонких срезов открыла огромные возможностидля применения электронной микроскопии буквально во всех областяхбиологии и медициныЭтот метод позволяет применять цитохимические приемы на уровнеэлектронной микроскопии: в данном случае необходимо, чтобы продуктыреакции были электронноплотными, отклоняли бы электроны.
Кроме того,реакции не должны приводить к появлению артефактных картин уже на50ультраструктурном уровне. Число цитохимических методов в электронноймикроскопии пока не велико, но это направление интенсивно разрабатывается.Вэлектронно-микроскопическихприменитьметодыисследованияхрадиоавтографии.Вэтомоказалосьслучаевозможнымиспользуютсясверхтонкозернистые эмульсии (величина гранул около 0,02-0,06 мкм).Недостатком этого метода является очень большое время экспозиции, внекоторых случаях достигающие нескольких месяцев.Все большее применение получают методы приготовления ультратонкихсрезов без фиксации и заливки клеток в твердые пластмассы. Это методыкриоультрамикротомии, т.е. получение срезов с замороженных тканей,моментально охлажденных до температуры жидкого азота (-196оС).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
