obshaya_tsitologia (1120994), страница 7
Текст из файла (страница 7)
При окрашивании живых клеток краситель собирается вцитоплазме в виде гранул, а в поврежденных или мертвых клетках происходитдиффузное окрашивание цитоплазмы и ядра.При изучении живых клеток широко используют флуоресцирующиекрасители и метод флуоресцентной микроскопии. Суть его заключается в том,что целый ряд веществ обладает способностью светиться (флуоресцировать,люминесцировать)припоглощенииимисветовойэнергии.Спектрфлуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению квозбуждающему флуоресценцию излучению. Так, например, выделенныйхлорофилл при освещении в ультрафиолетовых лучах светится красным цветом.Этот принцип используется в флуоресцентной микроскопии: рассматриваниефлуоресцирующих объектов в зоне коротких длин волн. Обычно в такихмикроскопах применяются фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовойобласти.
Существуют ультрафиолетовые люминесцентные микроскопы.36Собственной флуоресценцией обладают некоторые пигменты (хлорофиллы,бактериальныепигменты),витамины(АиВ2),гормоны.Есливофлуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, то на темно-синемфоне будут видны ярко светящиеся красные зерна внутри клетки – этохлоропласты.Можно применять метод флуоресцентной микроскопии, добавляя живымклеткам флуорохромы (флуоресцирующие вещества).
Этот способ сходен свитальным окрашиванием в том смысле, что здесь также используют оченьнизкие концентрации красителя(1 х 10-4–1 х 10-5). Многие флуорохромыизбирательно связываются с определенными структурами клетки, вызывая ихвторичнуюлюминесценцию.Так,например,флуорохромакридиновыйоранжевый избирательно связывается с нуклеиновыми кислотами. Причем,связываясь в мономерной форме с ДНК, он флуоресцирует зеленым цветом, а вдимерной форме с РНК светится красным цветом.
Наблюдая за живымиклетками, окрашенными акридиновым оранжевым, видно, что их ядра имеютзеленый цвет свечения, а цитоплазма и ядрышки святятся красным цветом. Темсамым в живой клетке с помощью этого метода можно видеть локализацию (а внекоторых случаях рассчитывать количество) тех или иных химическихвеществ.
Существуют флуорохромы, избирательно связывающиеся с липидами,слизью, кератином и др.В живые клетки можно инъецировать также меченые флуорохромамиантитела. Так, например, введенные в клетку связанные с флуорохромомантитела к белку тубулину соединяются с микротрубочками, которые теперьможно наблюдать в живых клетках с помощью флуоресцентного микроскопа.В последнее время начинает широко использоваться для изучения живыхклеток или их компонентов сочетание световой микроскопии (особеннофазовоконтрастной) с электроннно-компьютерной обработкой изображения.При этом используется видеозапись с электронной обработкой изображения,которая как бы «убирает» фоновые уровни и выделяет, контрастирует37наблюдаемые структуры.
Такая методика позволяет на телеэкране видеть такиеструктуры как микротрубочки, размер которых (20 нм) намного меньшеразрешающей силы светового микроскопа. Применение таких систем не толькозаменяют цейтраферную киносъемку, вместо которой используется видеозапись, но и позволяет компьютерную обработку изображения: сведения оплотности структур, о их параметрах, числе и трехмерной организации. Всочетании с флуоресцентной микроскопией эти методы открывают огромныеперспективы в изучении живых клеток.Обычныеметодысветовоймикроскопиитрудноиспользоватьдлявоспроизведения трехмерной картины изучаемого объекта из-за небольшойглубины резкости микроскопа. Обычно клетки рассматриваются как оптическиеразрезы на данной глубине фокуса. Для того, чтобы получить полнуютрехмерную реконструкцию объекта используют специальный конфокальныйсканирующий световой микроскоп.
С помощью этого прибора получаютсерии последовательных оптических срезов, взятых с различной глубины иизображения которых накапливаются в компьютере, и по специальнойпрограмме реконструируется трехмерное, объемное, изображение объекта.Обычно используются объекты, окрашенные флуорохромами.Изучение фиксированных клетокНесмотря на важность и достаточную простоту витальных наблюдений,большая часть сведений о структуре и свойствах клеток получена нафиксированном материале. Если клетку повредить, она начинает претерпеватьряд изменений, а после смерти клетки в ней активируются автолитическиеферменты, что приводит к грубым изменениям клеточной структуры.Следовательно, задачи фиксации – это убить клетку, прекратить активностьвнутриклеточных ферментов, предотвратить распад клеточных компонентов, атакже избежать потери структур и веществ, препятствовать появлениюструктур, отсутствующих в живой клетке (артефактные структуры).
К38сожалению, еще не найден такой химический фиксатор, который быудовлетворял всем этим требованиям.Часто для фиксации используются альдегиды и их смеси с другимивеществами. В качестве фиксаторов применяют также спирты, вызывающиенеобратимуюденатурациюбелков,осаждениенуклеиновыхкислотиполисахаридов. Осаждающим действием обладают такие сулемовые фиксаторыи фиксаторы с пикриновой кислотой. Фиксаторы, содержащие четырехокисьосмия (OsO4), хорошо сохраняют липиды.После фиксации объекты в дальнейшем можно подвергать дополнительнойобработке.
Одной из главных таких обработок является окрашивание клеток.Именно дополнительное окрашивание клеток позволило выявить в них массудеталей.Стекла с фиксированными мазками одноклеточных организмов или склетками культуры ткани можно непосредственно помещать в красители. Но дляокрашивания клеток в составе органов необходимо получить их срезы. Изучаюттакие срезы и отдельных клеток.Для этого после фиксации кусочки органов обезвоживают в спиртахвозрастающей концентрации, спирт замещают ксилолом, а ксилол – парафином.Таким образом, фиксированная ткань, минуя высушивание на воздухе,оказывается заключенной в твердую массу парафина, которую можно нарезать.Срезы толщиной до 5-10 мкм получают на специальном приборе –микротоме.
Такие срезы приклеиваются на предметное стекло: парафинрастворяется в ксилоле, ксилол удаляется спиртами, которые замещаются водой.Теперь срезы можно окрашивать водными растворами красителей. Дляизготовления постоянных препаратов окрашенные срезы снова обезвоживаютсяи заливаются в канадский бальзам под покровным стеклом, эти препаратыможно длительно хранить.Для окраски фиксированных тканей и клеток применяют различныенатуральные и главным образом синтетические красители.
Натуральные39красители (гематоксилин, кармин и др.) употребляют в сочетании с протравами(окислы различных металлов), с которыми они образуют комплексныесоединения (лаки).Синтетические красители подразделяют на кислые и основные. Основныекраски представляют собой соли красящих оснований, содержащие в своемсоставе аминогруппы, которые и определяют их щелочность. Такие красителиобразуют солевые связи с кислотными группами в структурах клетки.Следовательно, участки клеток, богатые кислотными группами, свяжутся сосновными красителями, будут, как их называют, базофильными.
Кислотныекрасители содержат в своем составе гидроксильные группы, или группы SO2OH.Структуры клеток с основными (щелочными) свойствами связываются скислотными красителями и называются ацидо- или оксифильными. Существуетмножество смесей таких красителей, которые одновременно могут окрашиватьразличные участки клеток в разные цвета и тем самым повышать контрастностьклеточныхивнеклеточныхкомпонентов.Такимобразом,используявсевозможные красители, исследователи не только добиваются четкостиморфологической картины клетки, но получают некоторые сведения о химизметой или иной структуры.Ряд красочных приемов, направленных на выявление специфическиххимических веществ, получил название гистохимических и цитохимических.Методов цитохимического анализа очень много.Существуетцелыйрядспецифическихкрасочныхприемов,прямовыявляющих те или иные вещества.
Это собственно гистохимические(цитохимические) реакции. Основные требования, предъявляемые к такого родареакциям, следующие: специфичность связывания красителя, неизменностьлокализации вещества.Примером такого рода цитохимических реакций может быть широкоприменяемая реакция на ДНК, реакция Фёльгена (рис. 8). Суть ее в том, чтопосле специфического кислотного гидролиза только на ДНК в результате40отщепления пуринов на дезоксирибозе образуются альдегидные группы. Этигруппы могут взаимодействовать со специфическим индикатором , реактивомШиффа (обесцвеченное основание фуксина), давая красное окрашивание вместах локализации ДНК. Связывание красителя в этом случае строгоколичественное, что позволяет не только обнаружить и указать места, где естьДНК, но и измерить ее количество.
Используя этот же принцип выявленияальдегидных групп, можно в клетках видеть расположение полисахаридов послегидролиза их периодной кислотой (так называемая PAS-реакция).Также специфически можно определить локализацию белков реакциями наотдельные аминокислоты (тирозин, триптофан, аргинин и др.). Липиды и жирыобнаруживают в клетках специальными красителями (судан черный), хорошорастворяющимися и аккумулирующимися в жировых включениях.Целая группа цитохимических реакций связана с обнаружением ферментов.Общий принцип этих реакций в том, что в микроскоп видны не сами белковыеферменты, а места их локализации, которые обнаруживаются по продуктам ихспецифической ферментативной активности.Количество конечного продукта цитохимической реакции можно определить спомощью метода цитофотометрии. Основу его составляет определениеколичества химических веществ по поглощению ими света определенной длиныволны.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
