obshaya_tsitologia (1120994), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Было найдено, что интенсивность поглощения лучей пропорциональнаконцентрации вещества при одной и той же толщине объекта. Следовательно,оценивая степень поглощения света данным веществом, можно узнать егоколичество. Для такого рода исследований используют приборы – микроскопыцитофотометры; у них за объективом расположен чувствительный фотометр,регистрирующий интенсивность прошедшего через объект светового потока.Зная площадь или объем измеряемой структуры и значение поглощения, можноопределить как концентрацию данного вещества, так и его абсолютноесодержание.
Широко используется метод цитофотометрии при определенииколичества ДНК на клетку после реакции Фёльгена. В данном случае41фотометрируется не сама ДНК, а содержание красно окрашенного фуксина,количество которого прчямо пропорционально содержанию ДНК. Сравниваяполученные величины поглощения со стандартами, можно получить точныезначения количества ДНК, выраженные в граммах. Этот метод позволяетизмерять количество ДНК до 10-12 – 10-14 г, в то время как микрохимическиеметоды имеют чувствительность не более 10-6 г. С помощью цитофотометриисодержаниеДНКвклеткахопределяетсянамноготочнееобычныхбиохимических методов.Количественную оценку получают не только поглощающие свет объекты ивещества, но и излучающие (светящиеся ).
Так, разработаны приемыколичественной флурометрии, позволяющие по степени свечения определитьсодержание веществ, с которыми связываются флуорохромы.Для выявления специфически белков применяют иммунохимическиереакциисиспользованиемиммунофлуоресценциифлуоресцирующихобладаеточеньантител.большойЭтотметодспецифичностьюичувствительностью. Его можно использовать для выявления не только белков,но и отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или для определениямест локализации РНК-ДНК гибридных молекул. Для этого сначала на белок(например,тубулин)получаютспецифическиесыворотки,содержащиеантитела. Очищенные антитела химически соединяют с флуорохромами. Такиепрепараты наливают на объекты и с помощью люминесцентного микроскопа посвечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке.Однако для того, чтобы меченные флуорохромами антитела проникли в клетку,необходимо плазматическую мембрану сделать проницаемой.
Обычно этодостигается фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран.Для изучения с помощью этого метода цитоскелетных белков прибегают крастворению клеточных мембран различными детергентами.Для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определенияпутей переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами42отельных клеток широко используют метод радиоавтографии – регистрациивеществ, меченных изотопами (рис. 9). Принцип этого метода очень прост, онповторяетметодБеккереля,открывшегорадиоактивныйраспад.Прирадиоавтографическом исследовании клеткам в среду вводится предшественникодного из макромолекулярных соединений (например, аминокислота илинуклеотид), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом.Например, вместопроцессе12синтезаС введен атомв14С, вместо водорода – тритий 3Н и др.
Вбиополимервключитсяимеченаямолекулапредшественника. Регистрировать ее место в клетке можно с помощьюфотоэмульсии. Если клетки в пласте или на срезе покрыть фотоэмульсией, точерез некоторое время в результате распада изотопа – частицы, разлетающиесяхаотично в разных направлениях, попадут в зону чувствительного фотослоя иактивируют в нем зерна бромистого серебра.
Чем больше будет времяэкспозиции, т.е. контакта такой меченой клетки с фотоэмульсией, тем большезерен AgBr будет засвечено. После экспозиции надо проявить препарат, приэтом происходит восстановление серебра только в засвеченных гранулах, прификсации препарата незасвеченные гранулы AgBr растворяются. В результатеиз массы гранул, которые покрывали объект, останутся только те, которые былиактивированыβ-излучением. Просматривая в микроскоп такие препараты,поверх которых нанесен слой фотоэмульсии, исследователь находит месталокализации зерен серебра, которые располагаются напротив мест, гдесодержится меченое вещество (рис.
9).Этот метод имеет ограничения: точность его будет зависеть от величинызерна AgBr и от энергии частицы. Чем больше величина зерна, тем с меньшейточностью можно узнать место расположения изотопа. И чем выше энергиячастицы и длиннее ее пробег, тем дальше от места распада будет происходитьактивация зерен AgBr . Поэтому для метода радиоавтографии используютособые мелкозернистые фотоэмульсии (0,2-0,3 мкм) и изотопы с малой энергиейβ-частиц, главным образом изотоп водорода, тритий (3Н). Тритием могут быть43мечены любые предшественники биологических макромолекул: нуклеотиды,аминокислоты,сахара,радиоавтографическихжирныекислоты.исследованныхИспользуютсямеченыегормоны,такжедляантибиотики,ингибиторы и др.
Радиоавтографически нельзя изучать растворимые в водесоединения, так как в процессе обработки клеток водными растворами(фиксация, проявление и т.д.) они могут потеряться. Другим ограничениемметода является достаточно высокая концентрация данных веществ, так как принизкойконцентрациирадиоактивноговеществавремяэкспозицииувеличивается, при этом растет опасность появления фона засвеченных гранулAgBr за счет космического излучения.Метод радиоавтографии – один из основных методов, позволяющих изучатьдинамику синтетических процессов, сравнить их интенсивность в разныхклетках на одном и том же препарате. Так, например, с помощью этого методапри использовании меченых предшественников РНК было показано, что всяРНК синтезируется только в интерфазном ядре, а наличие цитоплазматическойРНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.Метод радиоавтографии используется также для определения расположенияопределенных типов нуклеиновых кислот или отдельных нуклеотидныхпоследовательностей в составе клеточных ядер или хромосом – методмолекулярной гибридизации.
Для этого раствор с меченной нуклеиновойкислотой (например с рибосомной РНК) или с ее фрагментом (например, ссателитной ДНК) наносят на препарат, предварительно обработанный так,чтобы денатурировать ДНК (разорвать водородные связи в нативной ДНК) всоставе хромосом или ядер, что достигается щелочной или температурнойобработкой образца,. В процессе ренатурации ДНК происходит образованиемолекулярного гибрида между меченой нуклеиновой кислотой из раствора икомплементарным ему участком ДНК в препарате. Место такой гибридизацииопределяется радиоавтографически. Этот метод молекулярной гибридизациинуклеиновых кислот позволяет с большой точностью локализовать на44хромосоме места с данной нуклеотидной последовательностью или дажерасположение определенных генов.Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот используется такжепри окраске их флуорохромами. Например, если выделенную ядрышковуюДНК, ответственную за синтез рибосомных РНК, предварительно связать скаким-либо флуорохромом, то после проведения ренатурации ДНК напрепаратах с этой флуоресциирующей рибосомной ДНК, можно видеть, чтофлуоресценция будет наблюдаться только в ядрышках интерфазных клеток илитолько в зонах ядрышковых организаторов митотических хромосом.
Такимобразом можно в клетках локализовать любые последовательности ДНК и дажерасположение в ядрах отдельных хромосом. Этот прием называется FISH-метод(флуоресцентная in situ гибридизация).Электронная микроскопияРассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, чтоединственным путем увеличения разрешения оптической системы будетиспользование источника освещения, испускающего волны с наименьшейдлиной.
Таким источником может быть раскаленная нить, которая вэлектрическомполевыбрасываетпотокэлектронов,последнийможнофокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой длясоздания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуторазрешение в 1 А (0,1 нм). По принципу конструкции электронный микроскопочень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электроннойпушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив(объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы),только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экранили на фотопластинку (рис. 7).Основная часть такого микроскопа представляет собой полый цилиндр(колонка микроскопа), из которого откачан воздух для того, чтобы не быловзаимодействия электронов с молекулами газов и окисления вольфрамовой нити45накаливания в катоде электронной пушки.
Между катодом и анодом подаетсявысокое напряжение (от 50 до 200-5000 кВ), что служит причиной ускоренияэлектронов. В центре анода есть отверстие, проходя через которое электроныформируют пучок, идущий вниз по колонке микроскопа. Линзы электронногомикроскопа представляют собой электромагниты, поле которых может изменятьпуть электронов (как стеклянные линзы изменяют путь фотонов). Вконденсорной линзе пучок электронов фиксируется и попадает на объект, скоторым электроны взаимодействуют, отклоняются, рассеиваются, поглощаютсяилипроходятбезизменения.Электроны,прошедшиечерезобъект,фокусируются объективной линзой, которая формирует увеличенное первичноеизображение объекта.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
