obshaya_tsitologia (1120994), страница 10
Текст из файла (страница 10)
При этомпроисходит практически одномоментное торможение всех метаболическихпроцессов, а вода из жидкой фазы переходит в твердую, но не кристаллическую,ее молекулярная структура беспорядочна (стекловидное состояние). Такиетвердые блоки при температуре жидкого азота можно резать на ультратонкиесрезы (нож при этом также охлажден). Полученные срезы используют длявыявлениявнихактивностиферментов,дляпроведениянанихиммунохимических реакций, для ферментативного переваривания и т.п.Для проведения иммунохимических исследований используют антитела,связанные с частицами коллоидного золота, локализация которогонапрепаратах и указывает на места расположения искомого антигена.Изучение срезов, полученных на криоультратомах, показало, что общаяструктура и композиция клеточных компонентов в данном случае малоотличаются от того, что видно при использовании химической фиксации иобычныхприемовполученияультратонкихсрезов.Следовательно,теструктуры, которые имеют одинаковую композицию при разных методахобработки материала, по-видимому, близки к своему прижизненному строению,не являются артефактными.51В пользу этого говорят данные по исследованию клеток с помощью иныхприемов электронной микроскопии.Для изучения структуры различных мембранных компонентов клеткииспользуется метод замораживания–скалывания.
Он заключается в том, чтообъект сначала быстро замораживают жидким азотом, а затем при той жетемпературепереносятвспециальнуювакуумнуюустановку.Тамзамороженный объект механическим способом скалывается охлажденнымножом. При этом обнажаются внутренние зоны замороженных клеток В вакуумечасть воды, перешедшей в стекловидную форму, возгоняется («травление»), аповерхность скола последовательно покрывается тонким слоем испаренногоуглерода, а затем металла. Таким образом с замороженного и сохраняющегоприжизненную структуру материала получают реплику с его скола (рис. 12).Затем уже в условиях комнатной температуры ткань или клетки растворяют вкислотах, но пленка-реплика при этом остается цела, ее изучают в электронноммикроскопе. Этот метод имеет два преимущества: изучают реплики со сколовнативных образцов; исследуют рельеф поверхности мембран клетки, чтонедостижимо другими методами.
Оказалось, что и в этом случае общаяорганизация клетки и ее компонентов сходна с тем, что мы видим прихимической фиксации или при криотомии. Этот метод позволил увидеть, что какна поверхности, так и в толщине клеточных мембран располагаются глобулыинтегральных белков, что мембраны не однородны по своей структуре.Метод получения реплик с микрорельефа образца широко применяется приизучении фибриллярных компонентов клетки. Так при изучении цитоскелетаклеток культуры ткани или форменных элементов крови клетки обрабатываютдетергентами для того, чтобы растворить все мембраны. Это приводит к тому,что из клетки вымываются все компоненты, кроме фибриллярных белковыхкомпонентовцитоскелетаиматериалыядра.Такиепрепаратызатемфиксируются, обезвоживаются и специальным образом сушатся.
Вслед за этимсухие препараты напыляются углеродом и контрастируются распылением52тяжелых металлов, после чего такая реплика снимается со стекла, на которомросли клетки, и просматривается в трансмиссионном электронном микроскопе.Другие специальные методы электронной микроскопии биологическихобъектовВ последнее время начинают применять методы высоковольтной (вернее,сверхвысоковольтной) микроскопии. Сконструированы приборы с ускоряющимнапряжением 1-3 млн. вольт. Это очень дорогие приборы, что сдерживает ихширокое применение. Преимущество этого класса электронных микроскопов нев том, что на них можно получить более высокое разрешение (при болеекороткой длине волны электронов), а в том, что при высокой энергииэлектронов, которые меньше поглощаются объектом, можно просматриватьобразцы большой толщины (1-10 мкм).
Дополнительное использованиестереоскопической съемки позволяет получить информацию о трехмернойорганизации внутриклеточных структур с высоким их разрешением (около 0,5нм).Метод сканирующей (растровой) электронной микроскопии позволяетизучатьтрехмернуюкартинуповерхностиклетки.Присканирующейэлектронной микроскопии тонкий пучок электронов (зонд) пробегает поповерхности объекта и полученная информация передается на электроннолучевую трубку. Изображение может быть получено в отраженных иливторичных электронах. При этом методе фиксированный и специальнымобразом высушенный объект покрывается тонким слоем испаренного металла(чаще всего золота), отражаясь от которого электроны попадают в приемноеустройство, передающее сигнал на электронно-лучевую трубку.
Благодаряогромной глубине фокуса сканирующего микроскопа, которая значительнобольше, чем у просвечивающего, получается почти трехмерное изображениеисследуемой поверхности. Разрешающая способность этого типа приборовнесколько ниже, чем у просвечивающих электронных микроскопов, но ужесейчас выпускаются приборы с разрешением 3-5 нм (рис. 13).53Спомощьюрастровойэлектронноймикроскопииможнополучитьинформацию о химическом составе в тех или иных участках клеток.
Так, методрентгеноспектральногомикроанализаоснованнаидентификациииколичественной оценке содержания химических элементов по спектрамхарактеристическогорентгеновскогоизлучения,возникающегопривзаимодействии первичных электронов с атомами объекта. Для получения такойинформации, конечно, объекты не следует покрывать слоем металла, как приобычном методе сканирующей электронной микроскопии. Более того, объектнужно подготовить так, чтобы не было потери или дополнительного внесенияэлементов. Для этого используют быстро замороженные и высушенные ввакууме объекты.Фракционирование клетокВ цитологии широко применяют различные методы биохимии, каканалитические, так и препаративные.
В последнем случае можно получить ввиде отдельных фракций разнообразные компоненты и изучать их химическийсостав, ультраструктуру и свойства. Так, в настоящее время в виде чистыхфракций получают практически любые клеточные органеллы и структуры: ядра,ядрышки, хроматин, ядерные оболочки, плазматическую мембрану, вакуолиэндоплазматического ретикулума, его рибосомы, рибосомы гиалоплазмы,аппарат Гольджи, митохондрии, их мембраны, пластиды, пероксисомы,микротрубочки и т.д., и т.п. В последнее время получены чистые фракциицентриолей и ядерных пор.Получение клеточных фракций начинается с общего разрушения клетки, с еегомогенизации.
Затем из гомогенатов уже можно выделять фракции. Одним изосновных способов выделения клеточных структур является дифференциальное(разделительное) центрифугирование. Принцип его применения в том, чтовремя для осаждения частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности:чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на днопробирки.
Чтобы ускорить этот процесс оседания, используют ускорения,54создаваемые центрифугой. При центрифугировании раньше всего и принебольших (1-3 тыс. g)ускорениях осядут ядра и неразрушенные клетки, при 1530 тыс. g осядут крупные частицы, макросомы, состоящие из митохондрий,мелких пластид, пероксисом, лизосом и др., при 50 тыс. g осядут микросомы,фрагментывакуолярнойсистемыклетки.Приповторномдробномцентрифугировании этих смешанных подфракций можно получить чистыефракции. Так, при разделении макросомной подфракции получают отдельномитохондрии, лизосомы, пероксисомы.
При разделении микросом можнополучить фракцию мембран аппарата Гольджи, фрагментов плазматическоймембраны, вакуолей, гранулярного ретикулума. В случаях более тонкогоразделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотностисахарозы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незначительноотличающиеся друг от друга по удельной массе.Полученные фракции, прежде чем их анализировать биохимическимиспособами, необходимо проверить на чистоту с помощью электронногомикроскопа.Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность изучать ихбиохимию и функциональные особенности.
Так можно создать бесклеточнуюсистему для рибосом, которые будут синтезировать белок по заданнойэкспериментатороминформационнойРНК,выделенныемитохондриивподобранных условиях могут осуществлять синтез АТФ, на выделенномхроматине при участии соответствующих ферментов может происходить синтезРНК и т.д.В последнее время применяются бесклеточные системы для воссозданияклеточных надмолекулярных структур.
Так, используя очищенные от гранулжелтки, экстракты цитоплазмы яиц земноводных или яиц морских ежей, можнополучить ядра с ядерной оболочкой из введенной в эту бесклеточную системучужеродной ДНК (например ДНК бактериофага). Такая ДНК связывается сбелками-гистонами, которые есть в избытке в таком экстракте, образуется55хроматин(дезоксирибонуклеопротеид),которыйпокрываетсядвойноймембранной оболочкой, несущей даже ядерные поры. Такие модельные системыпомогаютизучатьтонкие,интимныепроцессы,напримертранспортмакромолекул из цитоплазмы в ядро и наоборот. В цитоплазматическихэкстрактах яиц земноводных и иглокожих такие ядра могут периодическиделиться путем митоза.
Эти модели внесли огромный вклад в расшифровкуприроды регуляции клеточного цикла.Большой вклад в биологию клетки вносят методы клеточной инженерии.Было найдено, что различные живые клетки могут сливаться друг с другом, еслиспециальными способами обработать их плазматические мембраны. Так можнослить эритроцит курицы и лимфоцит человека.
При этом получается двуядернаяклетка, гетерокарион, в котором происходит активация ядра куриногоэритроцита (рис.14). Если гетерокарион образуется из близкородственныхклеток (например, мыши и хомячки), то при вступлении их в митоз хромосомымогут объединиться в одну метафазную пластинку. После разделения такойклетки получится истинно гибридная клетка.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
