obshaya_tsitologia (1120994), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Если использовать ультрафиолетовый свет(260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 нм (0,13-0,14 мкм). Этобудетпределомтеоретическогоразрешениясветовогомикроскопа,определяемого волновой природой света. Таким образом, все, что может датьсветовой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу, - этоповысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженныйглаз человека имеет разрешающую способность около 0,1 мм, что равно 100мкм). Это и есть «полезное» увеличение микроскопа, выше которого мы будемтолько увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей.Следовательно, при использовании видимой области света 0,2-0,3 мкм являетсяконечным пределом разрешения светового микроскопа.Но все же в световом микроскопе можно видеть частицы меньшей величины,чем 0,2 мкм.
Это метод «темного поля», или, как его называли раньше, метод«ультрамикроскопии». Суть его в том, что подобно пылинкам в луче света(эффект Тиндаля) в клетке при боковом освещении светятся мельчайшиечастицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет от которых попадает в объективмикроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.Если же необработанные живые или мертвые клетки рассматривать впроходящем свете, то в них различаются только крупные детали из-за того, чтоони обладают иным коэффициентом преломления и поглощения световыхлучей, чем окружающая среда. Большая же часть клеточных компонентов малоотличается по этим свойствам как от среды (воды или тканевых растворов), таки друг от друга и поэтому мало заметны и не контрастны.
Для их изученияприходится изменять освещенность (теряя при этом в четкости изображения)или применять особые методы и приборы. Один из таких приемов – метод31фазово-контрастной микроскопии, широко использующийся для наблюденийза живыми клетками. Он основан на том, что отдельные участки прозрачной вобщем клетки хоть мало, но все же отличаются друг от друга по плотности и посветопреломлению.
Проходя через них, свет изменяет свою фазу, однако такоеизменение фазы световой волны наш глаз не улавливает, так как ончувствителен только к изменению интенсивности света. Последняя зависит отвеличины амплитуды световой волны. В фазово-контрастном микроскопе вобъектив вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую лучсвета испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построенииизображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся в одной фазе либо впротивофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светлотемное контрастное изображение объекта.Сходный прием используется в интерференционном микроскопе.
Онустроен так, что пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяетсяна два потока. Один из них проходит через объект и приобретает изменения вфазе колебания, другой идет, минуя объект. В призмах объектива оба потокавновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференциибудет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разнойтолщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степениконтрастности. В этом приборе, измеряя сдвиги фаз, можно определитьконцентрацию и массу сухого вещества в объекте.С помощью поляризационного микроскопа изучают объекты, обладающиетакназываемойсубмикроскопическихизотропией,частицт.е.(например,упорядоченнойволокнаориентациейверетенаделения,миофибриллы и др.).
У такого микроскопа перед конденсором помещаетсяполяризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостьюполяризации. После препарата и объектива помещается анализатор, которыйможет пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Поляризатор ианализатор – это призмы, сделанные из исландского шпата (призмы Николя).32Если вторую призму (анализатор) повернуть затем на 90о по отношению кпервой, то свет проходить не будет.
В том случае, когда между такимискрещенными призмами будет находиться объект, обладающий двойнымлучепреломлением, т.е. способностью поляризовать свет, он будет виден каксветящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можноубедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточнойстенке растений.Витальное (прижизненное) изучение клетокСветовой микроскоп позволяет видеть живые клетки. Для кратковременногонаблюдения клетки помещают просто в жидкую среду на предметное стекло;если нужно длительное наблюдение за клетками, то используются специальныекамеры. Это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкимистеклами, или же разборные плоские камеры. В качестве объектов можноиспользовать свободноживущие клетки простейших и других одноклеточныхорганизмов,клеткимногоклеточныхкровиорганизмовиликакжеразобщенныеживотного,тактканевыеиклеткирастительногопроисхождения.
В любом из этих случаев клетки изучают в специальноподобранныхсредах.Свободноживущиеодноклеточныеорганизмырассматривают и изучают в тех же средах, в которых они живут в естественныхусловиях или культивируются в лаборатории. Так, для некоторых простейшихсозданы искусственные среды, на которых они растут и размножаются. Обычноэто сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов илидругих простейших, служащих пищей для данного вида организма.Клетки крови или другие свободные клетки многоклеточных могут изучатьсяв капле плазмы или в специальных синтетических средах.Для изучения клеток органов и тканей животных используют методклеточных культур.
Более простой вариант этого метода заключается в том,что в камеру, наполненную питательной средой (смесь плазмы крови сэмбриональным экстрактом или смесь синтетической среды с добавлением33плазмы крови), помещают небольшой кусочек живой ткани.
Через некотороевремя на периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток. В другомслучае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором ферментатрипсина или хелатона - версена, что приводит к его диссоциации, к полномуразобщению клеток друг от друга. Затем такую взвесь отмытых клетокпомещают в сосуд с питательной средой, где они опускаются на дно,прикрепляются к стеклу и начинают размножаться, образуя сначала колонии, азатем сплошной клеточный пласт.
Так растут однослойные клеточные культуры,очень удобные для прижизненных наблюдений. Лучше всего для полученияпервичных культур из тканей животных использовать эмбриональный материал;культуры из клеток взрослых организмов растут очень плохо.При культивировании клеток вне организма кроме смены среды важноподдерживать и необходимую температуру (около 20о для хладнокровных иоколо 37о для теплокровных). Обязательным условием культивирования клетокявляетсясоблюдениекультивируемыхстерильности.клеток;этоСуществуетспециальныецелыйряддлительноклеточныештаммы,приспособившиеся десятилетиями к росту вне организма. Большей частью этоклетки опухолевого происхождения или значительно измененные клетки,приобретшие свойства опухолевых клеток.Сейчас метод культивирования клеток вне организма широко используется нетолько для цитологических, но и для генетических, вирусологических ибиохимических исследований.В культуре можно выращивать и растительные клетки.
Для этого кусочкиткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки.Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду,где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток.Наблюдения за живыми клетками обычно регистрируются в виде фотографий,сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроскопу.
Живые клеткиможно снимать и на кинопленку. В ряде случаев такая микрокиносъемка дает34оченьважнуюинформацию.Применяяускореннуюилизамедленнуюкиносъемку (цейтраферная киносъемка), можно подробно видеть протеканиетаких важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы,биение ресничек и т.д.Теперь с развитием компьютерных технологий с помощью специальныхтелекамер возможно получать изображение клеток прямо на мониторекомпьютера, записывать их в памяти компьютера, всячески обрабатывать иполучать отпечатки на принтерах цветных или черно-белых. Так же возможноиспользовать такую компьютерную видеотехнику для цейтраферной съемкиподвижных объектов .При исследовании живых клеток используют методы микрохирургии,оперативного воздействия на клетки.
С помощью прибора микроманипулятораклетки разрезают, извлекают из них части, вводят вещества (микроинъекция) ит.д. Микроманипулятор совмещается с обычным микроскопом, в которыйнаблюдают за ходом операции. Микрохирургическими инструментами служатстеклянные крючки, иглы, капилляры, которые имеют микроскопическиеразмеры и изготовляются на специальных приспособлениях – «микрокузницах».При микроманипуляциях клетки помещают в специальные камеры, в которыевводят также инструменты. Так, с помощью микроманипулятора удалосьпересадить ядра от одного штамма амебы другому и доказать, что именноклеточное ядро определяет физиологические особенности клетки в целом.
Спомощьюмикроманипулятораудалосьинъецироватьвклеткуамебыколлоидное золото, а затем исследовать распределение его частиц в цитоплазмеи ядре.С помощью таких микрохирургических инструментов можно поворачивать вклетках митотические веретена, оттаскивать отдельные хромосомы, вводить вживую клетку меченые антитела или разные белковые молекулы. Кромемеханического воздействия на клетки в микрохирургии в последнее времяшироко применяют микропучки ультрафиолетового света или лазерные35микропучки. Это дает возможность практически моментально инактивироватьотдельные участки живой клетки. Так, например, можно инактивировать одно изядрышек и следить за судьбой второго, интактного.
В этом случае показано, чтовторое ядрышко принимает на себя дополнительную нагрузку и «работает задвоих». С помощью микропучков удается поразить часть митотическойхромосомы или участок веретена деления. Оказалось, что поражениецентромеры хромосомы выводит последнюю из процесса расхожденияхромосом к полюсам клетки во время митоза. Недавно стали применятьаппараты с лазерным микролучом, что позволяет очень точно дозироватьколичество энергии в точке поражения и использовать очень короткие(наносекунды) импульсы облучения.При изучении живых клеток пытаются их окрашивать с помощью такназываемых витальных красителей. Это красители кислой (трипановый синий,литиевый кармин) природы, применяемые при очень большом разведении (1 :200000), следовательно, влияние красителя на жизнедеятельность клеткиминимальное.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
