Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 50
Текст из файла (страница 50)
А. Где находится сайт связывания стимулирующего фактора? Б. Почему добавление стимулирующего фактора в присутстви других очищенных компонентов транскрипции вызывает исчезв вение транскрнптов с матрицы, имеющей делецию в положе — 50? В.
Как вы полагаете, почему существует такая заметная раз в стабильности связывания этого стимулирующего фактора присутствии и в отсутствие ТР11Т)? 10-12 Вы провели клонирование нескольких неполных последовате ностей кДНК, кодирующей фактор транскрипции, в экспрессио ном векторе, чтобы определить, будут ли соответствующие зтщ Рве. 10-8. делеций, твкоидис 1О-!3). С 'рисунка < в рецепт< ДНК и у вортикои С-концов~ в аижней ставлены йвределет )тобавлен< там С'4.) шпио — зт Встуливш Ватна — пт вялой ил< х хлорам< (+) или < воти указ Фща<и ло) 4. Ехртя кленов Г, 0ЛРЕДЕЛЕНИЕ ЭХИЕДЛЕНИЯ б ГЕЛЕ ! х ку 2 с Э в А.
Б. В. 10 13 1 2 3 4 5 б Рхе 10-7. Структура неполных иендовательностей кДНК, коди- йчивп фактор транскрипции, (А) з определение кодируемых имн йегхов методом торможения в геле (Е). Радиоактивность полос обус- нмеяа меченой ДНК (эапача )ай). поло:какие с-конце в мутантнык Рецепторах о й) ооо й мото о о ! ! ! ! '1)Г' ! Рацаптор глюкакортиконла днк декоаметазан 1 ацатнллларемоеннкал оо ° о ФФ ФФ Дексаметазон Рте 10 й. Влияние С-концевых Лхсцяй на активность глюкокорвяояхного рецептора (задача .!Ы3). Схема в верхней части рсуяха показывает расположение арсцепторе участков связывания ~НК в участков связывания глюкоиутяхонда, а также локализацию 0хенцевых делеций. На схеме аавхлей части рисунка предпамеяы результаты стандартного иуехеяения активности САТ путем нйзачения к клеточным экстракни С'а-хлорамфеникола.
Нижнее .нуво-это хлорамфеникол, не Юуыкляй в реакцию, верхние Нтяа-продукты присоединения виой яли двух ацетнльных групп упораифениколу. Присутствие (4) вхв отсутствие ( — ) дексаметаЭигя ухаэано под соответствуюпви дорожками.
Контроль генной экспрессии 169 фрагментам части белка связываться с энхансером, узнаваемым целым фактором транскрипции. Клоны, содержащие неполные последовательности кДНК, укорочены на разные отрезки со стороньг 5'-конца гена (рис. 10-7,А). Вы транскрибируете, а затем транслируете эти клоны кДНК !и у)1го и смешиваете продухты трансляции с высокорадиоактивной ДНК, несущей энхансср. При анализе этих смесей методом электрофореза в полиакриламидном геле некоторые из белков, кодирусмых клонами кДНК, связываются с фрагментом ДНК, вызывая замедление его движения в геле (рис.
10-7, Б, дорожки 3, 4 и 5). Если перед транскрипцией и трансляцией смешать вместе клоны 3 и 4 кДНК, то в геле появятся три полосы (рис. 10-7,Б, дорожка 6). Почему запаздывающие полосы находятся в геле на разных уровнях? Где в молекуле фактора транскрипции расположен домен, связывающийся с энхансером? Почему при смешивании клонов 3 и 4 кДНК в геле появляются три запаздывающие полосы7 Какой вывод о структуре фактора транскрипции можно сделать на основе этих данных? Когда глюкокортикоидные гормоны присоединяются к рсцепто- рам, последние меняют свою конформацню, приобретая способность связываться с ДНК и активировать определенный набор генов. Результаты генетических и молекулярных исследований говорят о том, что участки связывания с ДНК и участки связывания с гормонами занимают разные области С-концевой части глюкокортикоидного рецептора, Присоединение ~ормона может способствовать связыванию рецептора с ДНК одним из двух способов: за счет изменения конформации рецептора и образования в результате этого домена, связывающегося с ДНК, либо за счет такого изменения конформации, при котором открывается ранее существовавший ДНК-связывающий домен.
Для анализа этих двух возможностей сопоставляли активности ряда фрагментов с последовательными делециями у карбоксильного конца (рис. 10-8). Фрагменты кДНК, соответствующие )ч)-концевой части рецептора, встраивались в вектор таким образом, что могли экспрессироваться после трансфекции в соответствующие клетки. Способность фрагментов рецептора активировать чувствительные к нему гены проверяли в ходе котрансфекции с индикаторной плазмидой, несущей чувствительный к глюкокортикоиду элемент, соединенный с геном хлорамфениколацетилтрансфсравы (СА?). Как показано на рис. !0-8, реакция Эацюиллларамфммкол ° Ф ФФФФФФ ф Хларамееннкол фф фф Фф Фф ФФ Фф фф фф фф ФФ ФФ + -+ -+ -+ + -+ -+ -+ — + + + 221 207 270 2эв 200 100 1аа 122 101 Ю 0 Отаутствуююие С-концавею аминокислоты 170 Глава 10 клеток, котрансфицированных кодирующей последовательност ьв интактного рецептора, была такой, как и ожидалось: в отсутствв ппококортиконда активность САТ не обнаруживалась, а в пр сутсгвни глюкокортикоида (дексаметазона) активность САТ ла.
ко выявлялась. Шесть мутантных рецепторов, у которых отсутс~ вовали 27, 101, 123, 180, 287 и 331 аминокислотный остаток в карбоксильном конце, были неспособны стимулировать экс прв, сию САТ в присутствии или в отсутствие дексаметазона. Напрв ' тив, четыре мутантных рецептора, у которых отсутствовали!я ' 220, 239 н 270 амииокнслотных остатков на карбоксильяв конце, активировали экспрессию САТ как в присутствии, и в отсутствие дексаметазона.
В специальных эксперимент бььчо показано„что мутантные и интактные рецепторы синге ровалнсь в равных количествах. Как данные этих экспериментов могут помочь выбрать о из предложенных моделей гормон-зависимого превращения н мального рецептора в форму, связывающуюся с ДНК? Ч происходит при связывании гормона: образуется сайт связыв с ДНК или же открывается существовавший ранее сайт свя ванна с ДНК? Молекулярно-генетические механизмы образования различных типОВ клеток (МБК 10.3) 10-14 Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. Сайт-специфическая инверсия сегмента ДНК у 5айнолейа, со вожцающаяся сменой типа синтезнруемого флагеллина, из под названием Б.
У дрожжей днплоидные клетки образуются в ходе проц ,при котором происходит слияние двух галлон клеток. В. Образование трех типов клеток у дрожжей — а, а и диплон а!а-контролируется главными белками-регуляторами, зако ванными в локусе Г.
Механизм переключения, от которого зависит, будет лн б риофаг лямбда размножаться в цитоплазме Е, сой (приво к гибели клетки-хозяина) илн же он встроится в ДНК кл хозяина, контролируется двумя белками — регуляторами фага лямбда— и Д. Исследования с помощью светового микроскопа, проведе в 1930-х гг., показали, что существуют области хромосом, нв наемые , которые не декоцценсируются в инт оставаясь в сильно конденсированном состоянии, характерв для метафазных хромосом. Е. У дрозофил хромосомные перестройки, при которых уч из центра гетерохроматиновой области переносится к ее ко граничащему с эухроматином, приводят к ннактивацин б лежащего эухроматннового гена за счет процесса, называем Ж.
Сегмент ДНК, локализованный на расстоянии 50 000 п.я. кластера глобиновых генов, содержит группу из шести чувствительных к нуклеазе сайгон, которые влияют на кластер; эта область называется 3. У бактерий, например у Е. со)1, есть фермент ДНК-топоизоме типа Н, называемая ; она использует энергию г лиза АТР, чтобы непрерывно создавать сверхвитки в Контроль генной экспрессии 171 и таким образом поддерживать в ней постоянное напряжение. В ДНК позвоночных содержится , который сходен с цитозином так же, как тимин с урацилом и подобно ему при замене не влияет на спаривание оснований. Последовательности СО встречаются в 10 — 20 раз чаще, чем обычно, в определенных участках, называемых , которые окружают промоторы так называемых генов гены кодируют белки, необходимые лишь в клетках определенного типа.
о ~е г- г- И К ), ,к ь 10-15 Г. Д И. К. Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие— нет. Если утверждение неверно, объясните почему. Фазовая вариация у эа(толе!!а и !т'. дологгйоеае происходит при инверсии гена. Смена типа спаривания у дрожжей происходит необратимо, поскольку при этом исходный ген в локусе МАТ, определяющий тип спаривания, удаляется и замещается геном другого типа спаривания. Два молчащих гена типа спаривания не транскрибируются в мес- те их локализации, поскольку в них отсутствуют соответствую- щие элементы промотора.
Белок-репрессор фага лямбда и его-белок могут взаимно подав- лять синтез друг друга, создавая своего рода молекулярный переклнэчатель на две позиции: он определяет лизогенное состоя- ние в случае преобладания репрессора или лнтнческое состояние в случае преобладания сго-белка. У дрозофилы некоторые белки-регуляторы, кодируемые главным геном, стимулируют транскрипцию своего гена. В то же время они подавляют транскрипцию главного гена„экспрессируемого в прилежащей части эмбриона на ранней стадии развития. Факультативный гетерохроматин, который локализован вокруг центромеры в каждой митотической хромосоме, находится во всех клетках в конденсированном состоянии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
