Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 54
Текст из файла (страница 54)
01. ~вйй" 1). ен ~ы э>и га У К' й н. > о й' в культивируемые лимфоциты должен образовывать мРНК СОКР? В. Если альтернативный процессинг происходит путем отбора сайтов сплайсинга, то какой из мутантных генов при введении в культивируемые лимфоциты должен образовывать мРНК СОКР? Г. Какая из двух гипотез лучше объясняет способность культивируемых лимфоцитов образовывать мРНК кальцитонина, а не СОКР? 10-24 Ферритин — это белок, который во многих тканях служит для запасания железа.
В присутствии железа синтез ферритина повышается почти в два раза. Вы хотите изучить молекулярные механизмы индукции синтеза ферритина. В особенности вас интересует,на каком уровне осуществляется контроль: во время транскрипции или после нее. Вы проводите серию экспериментов, в которых вводите крысам железо (в виде раствора соли железа) или физиологический раствор с одновременной инъекцией актиномипина Ту (мошный ингибитор синтеза РНК) или без нее.
Через три часа вы забиваете крыс, гомогенизируете их печень и выделяете фракции полисом и супернатанта. Затем выделяете из каждой фракции РНК и проводите трансляцию в бесклеточной системе в присутствии меченых аминокислот. Вы измеряете синтез суммарного белка по включению метки в белок, а синтез ферритина определяете путем осаждения антителами, специфичными к ферритину (табл. 10-4). Таблица 10-4. Синтез ферритнна и клетках крысы после различных вариантов обработки (задача 10-24) Актииомвцни П Фракции Суммаримв Синтез синтез феррцтини Числовые данные означают радиоактивность (яояияастао имнудьсоа а минуту), аияи чиашуюся а суммарный белок няи и фарритин.
А. Рассчитайте для каждого препарата, сколько процентов составляет синтез ферритина от синтеза суммарного белка. Приняв, что 85% суммарной мРНК во фракции полисом связано с рибосомами и 15% находится в свободном состоянии (в супернатанте), определите для каждого случая, сколько процентов составляет мРНК ферритина во фракции полисом и в супернатанте. (Примем, что процент мРНК в полисомной фракции и в супернатанте не меняется под действием актиномипина Г>.) Б.
Как с помошью ваших результатов можно определить, происходит регуляция синтеза ферритина (в зависимости от содержания железа) на уровне транскрипции или после нее? Гпава 10 Рве. 10-17. Ст1 человека н гя с геном 8-гло1 10-27). Светлы обозначают э а черные — экзо пения между и генов сую н в гибридных е в экзонах. В. 10-25 10 20 30 40 00 00 Время, мяя 10-15. Синтез белка в лизате еулопятов (задача 10-25). м н а т Регуляция АТПйцппдуекТС— 10-26 Ряе.
10.18. Р гибридных и сыворотки к1 Верхняя пол представляет содержащий е-~ок Нижня~ транскрнпт ( РНК), санте: который не 1 няе сыворот~ .1 0-16. Влияние мутаций на уляпвю стабяльности мРНК улнна (задача 10-26). Последоваьность дикого типа для первых аалцатн нуклеотидов кодируюач асти гена показана вверху, яад уонамя указаны первые 4 зааероваяные аминокислоты, яачиес метноняна (М). Нуклеотндез амены у двенадцати мутантов аведены ниже, причем указаны 2ько измененные нуклеотиды. уляцяя стабильности мРНК мечена справа: знак ( Ь ) означает вет дикого типа на азмененяя во утраклеточной концентрации 5учвна, знак (-)- отсутствие вета на изменения Как объяснить возрастание в два раза синтеза феррнтина в при.
сутствии железа? Весьма активную белоксинтезнрующую бесклеточную систем) можно получить из ретнкулоцнтов, которые представляют собо1 незрелые эритроциты, уже лишенные ядра, но еще сохранившж рибосомы. Лизат ретикулоцитов при условии добавления гею способен многократно транслировать каждую глобинов ув мРНК. Гем несет две функции: он необходим для сборки гема. глобина и, как ни странно, для поддержания высокого урови . синтеза белка.
Если не добавить гем, синтез белка через непрр должительное время останавливается (рис. 10-15). Первые сведения о том, как воздействует гсм на сиате глобина, были получены в простом опыте. Лизат ретикулоцита инкубировали в течение нескольких часов в отсутствие гема. Е сп 5 мкл такого предынкубированного лизата добавляли к 100 ма свежего лизата в присутствии гема, то наступало быстрое поды. ление белкового синтеза (рис.
10-15). В ходе дальнейшего изучь ния было показано, что ингибитор (названный гем-контроля. рующим репрессором, НСК) представляет собой белок с мох массой около 180 000. Очищенные препараты НСК в концентрг ции 1 мкг/мл полностью подавляли синтез белка в свежих лиза тах, содержащих гем. А.
Рассчитайте отношение числа молекул НСК к числу рибосох и молекул глобиновой мРНК при концентрации НСВ, полхэ ляющей синтез белка. Лизаты ретнкулоцнтов содержат ри бога мы в количестве 1 мг/мл (мол. масса рнбосомы около 4 мла) средняя полисома содержит 4 рибосомы на одну молеку глобиновой мРНК. Б. Каков механизм ингнбирования белкового синтеза в лизка ретикулоцитов репрессором НСК вЂ” каталитический или стехяр метрический, если судить по результатам расчета? Уровень экспрессии гена тубулина устанавливается при помо необычного способа регуляции: скорость синтеза нового тубу хв ' на регулируется внутриклеточной концентрацией свободных хв меров тубулина (состоящих из одной субъединицы а-тубухив и одной субъединицы ()-тубулина). Первые данные о сущестю ванин подобной саморегуляции получены в экспериментах с я)я паратами, которые вызывают сборку нли диссоциацию всеп тубулнна в клетке.
Если, например, обработать клетку колх жв . ном, который вызывает распад микротрубочек на отдельа субъединнцы тубулина, то наблюдается десятикратное сннж синтеза тубулина. Такая саморегуляпия синтеза тубулина гп димерами происходит не на уровне транскрипции, а скорее всп1 на уровне стабильности тубулиновой мРНК. Оказалось, что сап, . ответственный за саморегуляцию, содержится в последовате. ности первых 12 нуклеотндов кодирующей части мРНК.
Поскольку этот важный фрагмент мРНК перекрывается с и дирующим участком, то неясно, чем обусловлена регул стабильности мРНК; взаимодействием свободных днмеров ту8 лина с РНК или их взаимодействием с новосинтезнрован белком. Каждое нз этих взаимодействий могло бы, вероят запустить активность нуклеазы, которая разрушает мРНК.
Эти два предположения были проверены с помощью клони ванных вариантов гена, содержащих мутации в регуляторв области. Полученные мутантные гены вводили в клетки и нз Контроль генной экспрессии 183 Сает прнсоапинании ро1у(А! . 10-17. Строение гена с-Гпа осока н гибридов гена с-)оа илом р-глобнна человека (задача 27). Светлые прямоугольникн ачэют зкзоны гена суоб ссрлыс. зкзоны р-глобина. Соедиа макну последовательностями а с)оа и глобинового гена габридных генах локализованы язонах.
точка качана транскрипции А аи ро1у(А) б Гоа.гпобин ~ ро1урс) В Гоа -гпобин- би 3' ~ ро1у(А) Г гпобнн .С. ГБН с-Гоа ЧБПОВБКА Б, аи-ГПОБИН В. Аи-ГЛОБИН-Пи 3' 0 30 60 120 0 30 60 120 0 Зо 6О гяо 10-18. Реакции гена с)йт н радяых генов на добавление ротая крови (задача 10-27). дяпп полоса в каждом голе дставляет собой транскрнпт, держащий последовательность ' и. Няжняя полоса маркерный скрнпт (для контроля выхода ),синтезированный на гене, орый не реагирует на добаплесыворотки.
ли стабильность их мРНК при повышенной внутриклеточной концентрации свободных димеров тубулина. Результаты, полученные для двенадцати мутантов с измененной короткой последовательностью мРНК, приведены на рис. 10-16. От чего зависит регуляция стабильности мРНК тубулина; от взаимодействия его димеров с РНК или от их взаимодействия с закодированным белком? Объясните, на чем основан ответ.
10-27 Ген с-)щ является клеточным гомологом онкогена, содержатцегося в вирусе РВ) остеосаркомы мыши. Функция его неизвестна. Активация гена с-~ох — один из первых транскрипционных ответов на присутствие факторов роста: уровень транскрипции гена с-)оз в клетках мыши значительно возрастает в первые 5 мин, достигает максимума к 10-15-й мин и затем резко снижается. Для изучения временного механизма индукции гена с-)оз человека вы клонируете фрагмент ДНК, содержащий полную транскрипционную единицу, начинающуюся за 750 нуклеотидов до точки начала транскрипции и оканчивающуюся через 1,5 т.
п. и. после сайта полиаденилирования (рис. 10-17, А). Если вы вводите такой клонированный фрагмент в клетки мыши (что позволяет отличить мРНК гена с-)оз человека от зндогенного продукта клеток) и лишь на следующий день стимулируете рост клеток путем добавления сыворотки (богатый источник факторов роста), то наблюдается тот же тип индукции во времени, хотя она несколько более длительная, чем в случае гена мыши (рис.
10-18, А). 184 Глава 10 Проанализировав серию делеционных мутантов, вы покаи ваете, что для усиления транскрипции в ответ на сывороп необходим элемент ЫЕ, напоминающий энхансер (зеппп ге ролзе е1ешеп1 — элемент ответа на сыворотку) и расположенный ~ 300 нуклеотхщов до точки начала транскрипции. Вы изучаи также стабильность мРНК гена с-)ох, получая различные гибри ные гены, в которых содержатся части гена В-слабина человея копирующего очень стабильные мРНК. Строение глобиновох гена и гибридных генов приведено на рис.
10-17, Б В и Г. По введении гибридных генов в клетки, растущие при низком соде) жанни сыворотки, они отвечают на дополнительное введеях сыворотки через 24 ч, как это показано на рис. 10-18, Б и В. А. Какая часть гена с-)ой ответственна за нестабильность мР(й с-)ох? Б. Гибридный ген?ох-слабин содержит все обычные регуляторяя элементы гена с-)оя, включая н 8КЕ, и тем не менее его мРВ присутствует в начальный момент времени (через 24 ч посх трансфекции, но до введения сыворотки) и ее количество х увеличивается соответствующим образом после введения сыи, ротки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
