Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 49
Текст из файла (страница 49)
Однако даже в отсутствие белка п1гС РНК-полнмераза прочно связывается с промотором. Участие белка пггС в активации транскрипции исследовали далее с использованием трех различных матриц: обычного гена с интактными регуляторными последовательностями, гена с делегированным сайтом связывания п1гС и гена, в котором три из пяти участков связывания белка пПС перемещены к 3'-концу 1рис. 10-4, 160 Глава 10 Я. РЕГУЛЯТОРНАЯ ОБЛАСТЬ ввВАО Сейт встреивеиин еВДО Сейты, где белок егв С РНК-лолимереее свнеывеетсн с ДНК свнеывеетсн здесь и осуществлене регулнцию генов егеВАР 100 иуклеотидов Рве.
10-5. Расположслке сайтов связывания с белком агаС я оперонс агаВАР (А) и эффект изменения расстояния между байтами свяэыва- няд с агаС (В) (задача !0-10). В. Гены агдВАР замещены геном да(К, н в сайго встраивания добавлено вли делетлровано раз- личное число Вуклсотидов, как указано яа шкале внизу. Колонии клеток, ле экспресслрующих галвк- токинвэу;белые; колонии клеток, образующих галвктокняаэу,— крас- ВЫЕ. Б. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГАЛАКТОКИНАЗЫ Креснвн Белан -16 -11 -В О б 11 1В 20 24 31 Реемер есгевки А, Б и В соответственно).
В отсутствие фосфорилированного бе пггС транскрипции иа всех этих трех матрицах не наблюдал ась В присутствии 100 нМ фосфорилированного белка пггС транскр иг. ция во всех трех случаях достигала максимального уровня. Оди ы ' концентрации белка пггС, необходимые для достижения уров, синтеза, равного половине максимального, для этих трех гек значительно различались: для нормального гена (А) требовали .
концентрация 5 нМ, для гена с сайтом связывания на 3'-ко (В) — 10 нМ, а для гена с делегированным сайтом связывания шгС (Б) — 50 нМ. А. Если РНК-полнмераза может связываться с промотором гс глутаминсинтетазы в отсутствие белка пггС, то почему для актяв пин транскрипции нужен этот белок? Б. Если белок пггС может связываться с соответствующими сайт независимо от того, фосфорилирован он или нет, то почему транскрипции необходимо фосфорилнрование? В.
Если белок пггС может активировать транскрипцию даже в о тс?1 ствие сайтов его связывания, то зачем нужны эти сайты? 10-10 Механизм регуляции арабинозного оперона у Е. сой весь сложен. Кроме того, что соответствующие гены разбросаны хромосоме тремя группами, белок агаС, регулятор этого оп на, может осуществлять как позитивный, так н негатив контроль. Например, при регуляции группы генов агаВА (рис.
10-5, А) связывание агаС с сайтом 1 в присутствии араб позы (н в отсутствие глюкозы) повышает уровень транскр примерно в 100 раз по сравнению с начальным уровнем, изме ным в отсутствие белка агаС. Связывание агаС с сайтом 2 в с сутствие арабинозы подавляет транскрипцию генов агаВАР мерно в 10 раз по сравнению с начальным уровнем, измеренв в отсутствие белка агаС. Комбинация эффектов негатнвя контроля в сайте 2 (в отсутствие арабинозы) и позитнвн контроля в сайте 1 (в присутствии арабинозы) приводит к ты Контроль генной экспрессии 167 чекратному повьппеиию уровня транскрипции генов агаВА!) при добавлении арабинозы.
Механизм позитивной регуляции путем связывания с сайтом 1 представляется достаточно простым, поскольку этот сайт расположен по соседству с промотором, так что присоединение белка-регулятора„ вероятно, способствует связыванию РНК-полимеразы или образованию открытого комплекса. Однако вас больше озадачивают результаты связывания с сайтом 2. Сайт 2 расположен за 270 иуклеотндов до сайта начала транскрипции.
Регуляторное воздействие на таком расстоянии больше напоминает действие энхансеров в зукариотических клетках. Чтобы облегчить изучение механизма репрессии в сайте 2, вы помещаете всю регуляторную область перед геном да)К, кодирующим фермент галактокиназу, активность которой определить проще, чем активность ферментов, кодируемых генами агаВА!З. Для изучения того, какую роль играет расстояние, разделяющее два сайта связывания белка агаС„вы вставляете или делегируете нуклеотиды в точке встраивания, указанной на рис.
10-5, А. Активность промотора в отсутствие арабинозы можно затем определить по росту бактерий на специальных индикаторных атаровых пластинках, где при полной репрессии промотора образуются колонии белого цвета, а при синтезе галактокиназы— красного. Вы отмечаете цвет колоний против шкалы, на которой отложено количество удаленных или вставленных нуклеотидов (рис. 10-5,Ь). К вашему удивлению, белый н красный цвета чередуются.
Когда вы показываете эти результаты вашей руководительнице, она остается очень довольна и говорит вам, что эти эксперименты позволяют определить, какой из трех возможных механизмов репрессии на расстоянии действует в этом случае: 1) изменение в структуре ДНК распространяется от сайта репрессии на область транскрипции, и в результате промотор плохо связывает РНК-полимеразу; 2) белок в сайте репрессии связывается кооперативно (образуя олигомеры), при этом дополнительные субьединицы белка продолжают присоединяться до тех пор, пока растущая цепь из субъединиц не закроет промотор, блокируя транскрипцию; 3) ДНК образует петлю таким образом, что белок, связавшийся с отдаленным сайтом репрессии, будет взаимодействовать с белками (или с ДНК) в точке начала транскршшни.
Какому из этих трех механизмов соответствуют полученные вами результаты и как вы можете объяснить чередование белых и красных полос? 10-11 Вы разработали систему транскрипции 1п чйго, используя определенные сегменты ДНК, транскрибирующиеся под контролем вирусного промотора. Система начинает работать, когда вы добавляете очищенную РНК-полимеразу 11, ТР!!О (белок, связывающийся с ТАТА-боксом), ТР!!В и ТР11Е (которые связываются с РНК-полнмеразой).
Однако эффективность транскрипции в этой системе )п чйго низка, поэтому естественно предположить, что могут существовать и дополнительные регуляторные последовательности, связывающие те факторы, которых нет среди очищенных компонентов. Для идентификации последовательностей ДНК, с которыми связываются эти гипотетические факторы регуляции, вы получаете серию делеций перед точкой начала транскрипции (рис. 10-6,Ь)и сравниваете активность транскрнп- 188 Глава 10 470 Л. ЦЕЛАЯ МАТРИЦА 4. КАРТ< +1 1 2 3 4 6' Сайг свнаыванин РНК лолимарааы +1 Б.
делетиРОЕАнные мАтРицы Б. ОПРЕ< ЗАМЕ -61 Фт -60 .11 ДНК глава от атну точек далатирована 1 $2 у й 3 й' 4 В, ТРАНСКРИПЦИЯ 1Н Ч1ТЯО Ядерный экстракт Систама с очнманнымн комлонантамн Фщг чика <МИ» ~ <МИа Дикий Доловил.~ 4юв авиа ююч -11 .60 Фт 01 .127 Конан -11 -60 411 .01 -127 далатирован. ного фрагмента Рве. 10-7 исследо! рующих я опредс белков ы (В). Рад! ловлена 10-12). Рве. 10-6. Транскрипция под конт- ролем вирусного промотора (зада- ча 1О-11). Л. Неделетироваииад матрица.
Бй Делетироваиные мат- рицы. Нв иеделетированной матри- це образуется траискрилт, который нв 80 нуклеотидов длиннее, чем траяскрилты с матриц, несущих делеции в расположенных выше лромотора регуляториых областях. При делениях удаляется участок слева ог места, указанного стрел- кой. Нуклеотиды пронумерованы от точки начала транскрипции (+ 1), отрицательными числами обозначены нуклеотиды, располо- женные перед точкой начала транс- крипция. В. Результаты транскрип- ции смеси делегированных и ие- делетироваииых матриц в грубом экстракте (слева)и цри использова- нии очищенных компонентов (сцрава).
Отрицательные числа означают, какую из делегирован- ных матриц включали в смесь, ции в очищенной системе и в грубых экстрактах. В качеств: виутренного контроля вы смешиваете препарат каждой из де хо тированных молекул с препаратом целой матрицы, транскрввт . с которой имеет несколько большую длину (рис. 10-6, А). Резу ль таты этих определений приведены на рис. 10-6, В. Делеции вплел до положения — 61 не влияют на транскрипцию, а делеци в положении — 11 инактивнруег транскрипцию как в очищению системах, так и в экстрактах. Удивительно, что ДНК с делецяп в положении — 50 транскрнбируется так же эффективно, юк.
и неделетированная матрица в очищенной системе„ но не в лф трактах. Вы вьщеляете белок, ответственный за этот эффект, и поц зываете, что он стимулирует примерно в 10 раз транскрнлц йв' с неделетированной матрицы и с ДНК, несущей делецию в поло: женин — 61, но не стимулирует транскрипцию с матрицы, солар жащей делецию в положении — 50. Результаты футпринтя ял показали, что этот фактор связывается с определенной коротх последовательностью, расположенной перед ТАТА-боксом. Бо лес того, если в отсутствие ТНЮ этот фактор связывается своим сайтом на очень короткое время (время полужизни 20 с), то в присутствии ТР11Р он связывается стабильно (время по.ту, жизни превышае~ 5 ч).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
