Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 44
Текст из файла (страница 44)
3'-Конец большинства транскриптов, образуемых РНК-полимера- зой П, формируется при терминации транскрипции, когда к осво- бодившемуся 3-'концу быстро присоединяется последовательность ро1у(А). Лишь около 5% РНК, синтезируемой РНК-полимеразой П, дости- гает цитоплазмы: вся остальная распадается в ядре. Сплайсинг РНК происходит в ядре, где рибосомы отсутствуют, и РНК экспортируется в цитоплазму только по завершении про- цессинт а. Частицы гяРНП и мяРНП похожи на рибосомы, так как каждая из них содержит много полипептидных цепей, образующих комплекс со стабильной молекулой РНК. Поскольку интроны представляют собой главным образом «связ- ку» между генами, то совсем необязательно, чтобы в ходе сплай- синга они были вырезаны из первичного транскрипта с большой точностью.
Сплайсннг РНК дает возможность получать из одного и того же первичного транскрипта РНК несколько разных мРНК и соответ- ственно несколько разных белков. 9-24 А. Г. К. У. Соединение молекул рРНК с рибосомными белками происходит в ядре, в крупной, хорошо различимой структуре, называемой ~48 Глава 9 Рке. 9-21. Ст (А) и резул~ траяскряпшп (Ь) (задача 9 вые смеси лз меразу П, фз я ззр СГР 1 кентов отме дорожкой: (- поиепт ирису смеси, ( — ) о: отсутствует. Главное различие между самосплайсирующимися интронзи групп 1 и 11 состоит в том, что у интронов группы 1 атакуюпв( нуклеотид свободен, а у интронов группы 11 он входит в соси интронной последовательности.
В клетках большинства позвоночных кластер генов, кодирующя 288-рРНК, транскрибируется независимо от кластера генов, колз рующих 188- и 5,88-рРНК. Рибосомные РНК образуются в ядрышке-спецнализнровавнд области ядра, а затем переносятся в цитоплазму, где они свюи' ваются с рибосомными белками и образуют рибосомы. В отличие от цитоплазматических органелл ядрышко не огравз чело мембраной. В клетках, находящихся на стадии метафазы, ядрышко отсугп вует. Полагают, что деконденсированные хромосомы в интсрфазяи клетках в значительной степени переплетены между собой.
Н О П 9-26 Используя свой быстрый метод определения специфической тра 9-25 Вы измучились с определением факторов специфической трав криппии: все процедуры довольно длительны, а факторы част оказываются нестабильными. К тому моменту, когда вам напою удается идентифицировать искомую фракцизо, фактор уже терм свою активность. И вот в один прекрасный день вам в голоа приходит блестящая идея по поводу того, как ускорить опрело ние. Вы придумали, что можно получить последовательноп( ДНК, не содержащую С, встроить ее рядом с промотором и п)в', инкубировать такую конструкцию в соответствующей реакпиоз ной смеси. В этом случае с промотора будут синтезировать( транскрипты, не содержащие О.
В отсутствие ОТР на сконстр)4 рованной вами последовательности ДНК будет синтезироваты~ единственный длинный транскрипт РНК. Если это удастся погй зать, то вы сможете легко определять специфическую транскрия, цию, просто измеряя включение меченого нуклеотида. Для проверки своей идеи вы конструируете две плазмия1 несущие такие тест-последовательности ДНК: одну плазмиду( промотором из аденовируса (рМ1,1) и другую без него (рС1). смешиваете каждую из этих двух плармид с очищенной РНК-по меразой 11, вашими лучшими препаратами факторов транскр ции и 'зР-СТР. Кроме того, вы добавляете в разных сочетанв ОТР, РНКазу Т1, разрезающую РНК рядом с каждым О, и 3' метил-ОТР, который при включении в растущую цепь Р терминирует транскрипцию.
Вы определяете продукты реак с помощью гель-электрофореза, результаты которого показаны рис. 9-21. А. Почему транскрнпт размером 400 нуклеотидов, отсутствующий дорожке 4, присутствует на дорожках 2, 6, и 8? Б. Можете ли вы определить, почему происходит синтез в об нанесенном на дорожку 3, где взята плазмида, не несущая и . мотора? В.
Почему транскрипт размером 400 нуклеотидов присутствует дорожке 5, а на дорожке 7 отсутствует? Г. Вы разработали этот хитроумный метод, чтобы определзггь фа ры транскрипции. Один из ваших коллег замечает, что идентя$ ' . кацию нужно проводить сначала в грубых экстрактах, котор содержат ОТР. Сможете ли вы определить специфическую крипцию в грубых экстрактах? Как это сделать? Клеточное ядро 149 4 ТЕСТ.ПЛАЗЧИДЫ Промотор аденовируоа Транокрнлт, устойчивый у'кРНКаз ту Сннтетичеокая ветавка (400 л,н,) Вектор вектор ж определение трднскрипции а ч1тло Ри каза Т1 Злс.метил СТР 400 нуклеотидов 9-2!. Строение тест-цлазмнд ) я результаты определения ахрвлвяв црв разных условиях (ввдвча 9-25). Во все реахцвовеиеои добавляли РНК-полву П, факторы транскрипции иР.СТР. Наличие других комцоов отмечено вдд каждой ай: (+) означает„' что хомприсутствует в реакционной , (-) означает, что компонент ует.
плазмида с мь с мх с мь с мь атр — — + + + + + + крипции (см, задачу 9-25), вы устанавливаете, что транскрипция нарастает линейно в течение часа и затем выходит на плато. Объем реакционной смеси при определении составляет 25 мкл, и в ней присутствуют ДНК-матрица в концентрации 16 мкгумл (плазмида рМ1.1 длиной 3,5 т.п.н.) и другие компоненты в избытке.
По специфической активности 'хР-СТР и общей радиоактивности транскриптов вы вычисляете, что к моменту достижения плато включилось 2,4 пмоль СМР. Каждый транскрипт имеет в длину 400 нуклеотидов и суммарный состав СхА(). (Масса одной нуклеотидной пары составляет ббО дальтон.) А. Сколько транскриптов образуется в ходе реакции? Б.
Сколько матриц участвует в каждой реакции? В. Сколько транскрнптов в расчете на одну матрицу образуется в ходе этой реакции? 9-27 Как упаковка ДНК в хроматнне влияет на транскрипцию у эукариот? Вы предполагаете решить эту задачу в лоб, используя не содержащую С транскрипцнонную единицу (полученную в задаче 9-25). Эта матрица хорошо транскрнбируется в присутствии РНК-полимеразы Н и четырех факторов транскрипции-ТН1А„ ТН1В, ТН1Р и ТН1Е. Для изучения влияния хроматина на транскрипцию вы сначала упаковываете матрицу в нуклеосомы (используя экстракт из ооцитов лягушки), выделяете хроматнновую матрицу и затем добавляете компоненты, необходимые для транскрипции.
Транскрипция не идет (рис. 9-22, дорожка 2). Тохда вы пытаетесь проделать все это в ином порядке. Сначала вы инкубируете матрицу с компонентами, необходимыми для транскрипции, но в отсутствие нуклео- 160 Глава 9 днк О О все -А —  — О -Š— П все Превмнкубация Транскрипция асе асс все вст все все все -А -В -О -Е -К Транскрипт Рис. 9-22. Влияние сборки хрома- тина иа транскрипцию (задача 9-27). Матрицы для траискриппии предынкубировали в разных усло- виях: в отсутствие всех компоиеи- тов, иеобходимых для траискрип- ции; добавив вес, кроме какого- либо одного компопеита (иапример, — А означает, что отсутствует ТР1!А, и — 11 означает, что отсут- ствует РНК-полимераза П),' в при- сутствии всех компонентов.
Опре- деление траискрипции проводили в присутствии всех или всех за исключением одного компонентов траискрипции. зидтрифосфатов ()ц)ТР), затем упаковываете матрицу в нуклеоа мы и выделяете хроматиновую матрицу. Когда вы теперь добаз ляете компоненты, необходимые для транскрипции (в присутствв )н)ТР), транскрипция идет так хорошо, как будто вы проводите е с очищенной ДНК (дорожкн 1 и 3). Отсюда вы делаете вывод, чт с матрицей должны связаться один или более компонентов трап крипции, которые и обеспечивают доступ к промотору.
Для более подробного анализа этого явления вы проводите гд дополнительных опыта. В ходе одного из них вы не добавлял отдельные компоненты, необходимые для транскрипции, в течедг предварительной инкубации (дорожки 4 — 8). Во втором опыте в не добавляете отдельные компоненты, необходимые для трвн" крипции, в ходе самой транскрипции (дорожки 9 — 13).
А. Какой из компонентов, необходимых для транскрипции, долив присутствовать во время предварительной инкубацни, чтобы мц рица сохраняла свою активность при сборке хроматина? Рн Какой из компонентов, необходимых для транскрипции, образу( с матрицей комплекс, оказывающийся устойчивым при сборв' хроматина и последующей очистке? В. Какой из компонентов, необходимых для транскрипции, следу( добавить в ходе реакции, чтобы получить транскрипт? 9-28 Трипаносома — микроорганизм, вызывающий сонную болезии может изменять состав своей гликопротеиновой оболочки и танк образом зашншаться от иммунного ответа хозяина. Вы изучасз)1 синтез вариабельного гликопротеина оболочки (ЧВΠ†ча)( впг(асс я)усоргоге(п) и уже картировали ген, кодируюШий зтй белок и расположенный вблизи теломеры одной из хромоса( Однако вам не удалось локализовать промотор.
Из ваших дания~. следует, что его может отделять от гена ЧЯО много тыся нуклеотидов. Ваш друг уже давно предлагал использовать для картировавя промотора облучение ультрафиолетом-метод, который уже хору( шо зарекомендовал себя при картированни транскрнпциоият~ единицы аденовируса. РНК-полимераза не может продолжв транскрипцию через пиримидиновые димеры, возникаюшие в зультате облучения ультрафиолетом, поэтому чувствительн транскрипции к облучению ультрафиолетом можно использова как меру расстояния между началом транскрипции и той точкф в которой вы определяете транскрипцию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
