Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 40
Текст из файла (страница 40)
Один из ваших коллег идентифицировал два основных гистоноподобных белка, связанных с ДНК (их масса примерно равна массе ДНК). Вы выделяете из клеток ядра и обрабатываете их микрококковой нуклеазой в течение разных периодов времени. Затем вы выделяете ДНК и разделяете ее в агарозном геле параллельно с аналогичным препаратом ДНК из ядер печени крысы. Как показано на рис. 9-7, продукты расщепления ДНК из печени крысы дают стандартную лесенку полос, характерную для нуклеосом, тогда как продукты расщепления ДНК марсианского микроорганизма проявляются в виде растянутых зон шлейфа, причем размер минимального фрагмента составляет около 300 нуклеотидов.
В качестве контроля вы выделяете из марсианского микроорганизма ДНК, свободную от белков, и обрабатываете ее микрококковой нуклеазой. ДНК оказывается весьма чувствительной к этой нуклеазе, и конечными продуктами расщепления являются преимущественно моно- и динуклеотиды. Указывают ли эти результаты на то, что в хроматине марсианского микроорганизма также содержатся структуры, подобные нуклеосомам? Если это так, то как расположены такие нуклеосомы по длине ДНК? Строение нуклеосом в области центромеры представляет особый интерес в связи с тем, что центромера является областью присоединения хромосомы к микротрубочкам.
Для прикрепления трубочек обычное расположение нуклеосом в хроматине, возможно, должно быть изменено. Вы собираетесь разобраться в этом вопросе, поскольку провели клонирование н определили последовательность нуклеотидов во фрагменте ДНК длиной около 2 т.п.н., который расположен вокруг центромеры (СЕХЗ) дрожжевой хромосомы 1Н.
В результате вы можете изучить расположение нуклеосом нс только в нативной хромосоме, но также и в плазмиде, с помошью которой вы клонировали различные по длине фрагменты той области хромосомной ДНК, которая окружает центромеру (рис. 9-8). Вы выделяете хроматин из дрожжей дикого типа и нз дрожжей, несущих отдельные плазмнды. Затем кратковременно обрабатываете эти препараты хроматина микрококковой нуклеазой, после чего депротеинизируете ДНК и обрабатываете ее нуклеазой Ва1пН1, которая разрезает ДНК лип1ь в одном месте — в области центромеры (рис. 9-8). ДНК, обработанную таким образом, вы фракционируете с помощью гель-электрофореза и затем анализируете методом блот-гибридизации, используя в качестве зонда фрагмент радиоактивно меченной ДНК центромеры (рис.
9-8). Этот метод, называемый «непрямое мечение концов», позволяет выявить все фрагменты ДНК, начиная с ДНК, расположенной непосредственно справа от участка расщеплении ферментом ВагпН1. Контрольный опыт состоит в том, что вы депротеинизируете препарат хроматина, чтобы получить чистую ДНК, обраба- 9-10 В. Объясните, как гипотеза вашего коллеги объясняет образование фрагментов, отличающихся друг от друга по длине на 10 нуклеотидов, при обработке ядер ДНКазой 1.
136 Глава 9 Натнанан хромооома СЕЯЗ Ппазмида 1 СЕНЗ Бактариапьнан ДНК Плазмида 2 1660 1400 1240 сенз 1060 020 760 ДНК дромжай Баитнзнапьнан ДНК Плазмида 3 сеиз Зонд дпп гибридизации, 627 п.н. Збо Рис. 9-9. макрокс центром ча 9-!О) автогра1 длины ~! Рае. 9-8. Схема натнвной хромо- сомы н трех плазмид, сконструиро- ванных вокруг СЕХЗ !задача 9-!О). Натнвнад хромосома имеет линей- ную форму; ее копны на самом деле продолжаются далеко за сайты, отмеченные диагональными ли- ниями.
Плазмилы представлюот собой кольцевые молекулы, но здесь ллд удобства онн изображены в линейной форме. Натнвные дрожжевые последовательности, окружающие центромеру, обозна- чены линиями. Последовательности бактериальной ДНК в составе плазмилы изображены как черные прямоугольники. Дрожжевая ДНК в составе плазмнлы 3, изображен- ная как светлый прямоугольник, представляет собой фрагмент хро- мосомной дрожжевой ДНК, от- стоящий далеко от центромеры. Сайт разрезания ВащН! показан черным кружком слева от центро- меры. Область гибриднзапин с радиоактивным зондом указана внизу. тываетс ес микрококковой нуклеазой и затем анализируете тем в способом.
Результаты радиоавтографии приведены на рис. 9-9. А. Если не проводить обработку ВащН1, то видны регулярные, хор и не очень отчетливые полосы. Почему в результате расщеплена ВащН1 картина делается более четкой и легко подпающейа интерпретации? Б. Нарисуйте схему локализации участков, чувствительных к микро кокковой нуклеазе, и расположения нуклеосом вдоль хромосоме Какие особенности отмечаются в области центромеры? В.
Почему в качестве контроля в эксперименте используется чисти ДНК? Г. На радиоавтограмме Грие. 9-9) видно, что полосы, относяшиеа к той части хромосомной ДНК из дрожжей дикого типа, которб расположена за центромерой, отличаются друг от друга на однао ковое число нуклеотидов, а именно все полосы, начиная с Я нуклеотидов и выше, разделены интервалом в !60 нуклеотидп! Связана ли такая регулярность с выстраиванием нуклеосом вблю! центромеры подобно машинам при красном свете светофора? Ид же эта регулярность определяется свойством самой последоватеь ности ДНК? Объясните, как ваши результаты, полученные с плдз мидами 1, 2 и 3, могут помочь ответить на этот вопрос. Структура хромосомы !МБК 9.2) 9-11 Заполните пропуски в следующих утверждениях. А.
Общим принципом структурной организации хромосом являетсй' по-вндимому, наличие в них , которые представляю! собой петли хроматина, отходящие под тем или иным углом е основной оси хромосомы. Б. На стадии метафазы в процессе митоза две дочерние молекуж ДНК уложены каждан по отдельности в виде двух сестринстц которые соединены между собой с помощьз) центромер. В. Набор из 46 митотических хромосом человека называещ человека. Г. Спаренные мсйотические хромосомы в растущих ооцитах назып ют , так как петли хроматина у них необычно тугй и вьггянутые. Д.
Плотное прилегание одна к другой отдельных цепей хроматей? Клеточное ядро 137 ч % деконденсируются и образуют хорошо различимые хроматин чрезвычайно чувствителен к действию нуклеазы. По-видимому„нуклеосомы в нем изменены таким образом, что их упаковка становится менее плотной. 3. Небольшая фракция ДНК из клеток высших эукариот — это особо !НО Л00 !Н0- конденсированная форма ДНК, называемая Эти участки ДНК остаются необычайно компактными в течение интер- фазы и не транскрибируются. !Не не- ге! Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а ка- кие — нет. Если утверждение неверно, объясните почему. Петельные домены у столь несхожих организмов, как муха и чело- век, судя по всему, имеют в среднем одинаковые размеры, причем типичная петля содержит от 20000 до 100000 пар нуклеотидов.
Сверхспирализация хромосом в митозе, приводящая к уменьше- нию длины ДНК примерно в 10000 раз, сопровождается интенсив- ным фосфорилированием гистона Н1. Окрашивание митотических хромосом флуоресцентными краси- телями позволяет в основном отличать ДНК, богатую АТ-парами нуклеотидов (О-сегменты), от ДНК, обогащенной ОС-парами (В-сегменты). В хромосомах типа ламповых щеток большая часть хроматина находится в составе активно транскрибируемых петель, а неболь- шая часть хроматина остается в высококонденснрованном состоя- нии в хромомерах„которые траскрнпционно неактивны. У личинок мух в секреторных клетках некоторых типов все копии гомологичных хромосом, синтезированных за несколько циклов репликации, остаются рядом друг с другом, что приводит к обра- зованию гигантской полиплоидной хромосомы.
Изучение хромосомных пуфов показало, что петельный домен, который, как полагают, должен сложиться, чтобы образовался хромосомный диск, в ходе транскрипции может деконденсиро- ваться как отдельная единица. Данные классической генетики вместе с последними результатами молекулярно-биологических исследований показывают, что каж- дый диск на политенной хромосоме, вероятно, соответствует одному гену.
При обработке ядер из различных клеток ДНКазой 1 в определен- ной концентрации разрушаются преимущественно те последова- тельности ДНК, которые в клетках данного типа активно транс- крибируются. В активном хроматине нуклеосомы избирательно связывают два небольших близкородственных хромосомных белка НМО14 и НМО17. Транскрипционно неактивные области хромосом представляют собой ДНК в конденсированной форме, относительно устойчивой к нуклеазам; эту форму ДНК называют гетерохроматином. 9-12 А.
же тя ия ся В. Но- оы, Г. ая Р00.9-9. Результаты обработки нарококковой нуклеазой около- цлпромерного участка ДНК (зада- 009-10). На левой стороне ралло- ипограммм указаны примерные ьн!пы фрагментов ДНК (п. н.). ся ая а- 30 в. ти тн ь- з- Е. 3. я, гт К. ы !х о 9-13 Вы изучаете транскрипцию на хромосомах типа ламповых щеток у тритона ТПгигит, вводи зН-уриднн в ооциты и определяя через равные промежутки времени радиоактивную РНК методом радиоавтографии. Сначала вы исследуете самые большие петли.
Метка включается постепенно вдоль всей петли, как это показано на рнс. 9-10. Процесс мечения всей петли занимает 14 сут. Проведя :е в приводит к значительному удлинению оси хромосомы и препятствует опутыванию цепей хроматина. Е. Активно транскрибнруемые области на политенных хромосомах 38 Глава 9 2881 21 Я Р О Р 'ас. 9-10. Радяоавтография гигант- кой хромативовой петли в цре- нрате хромосом типа ламповых цеток из тритона (задача 9-13). :урслкамн указано распростране- 1ае меченых областей вдоль петли ~ разные моменты времени после ~веления в ооцит меченого урндина. 14 Полнаау и мсяеинея пеум 4 ввеления Н урилине о Неме е ея пеуля ВРемя, см и паоле сравнение его с процессом мечения маленьких петель, горазд1 чаще встречающихся в хромосомах типа ламповых щеток, ва удивлены результатами; петли меныпего размера метятся равнс. мерно даже за очень короткие промежутки времени. При увеличении времени инкубации интенсивность мечения увеличиваетс1 равномерно вдоль всей петли.
Многие петли в хромосомах типа ламповых щеток представ лают собой отдельные единицы транскрипции, в которых РНК-пр лимераза начинает и заканчивает синтез у основания петли, кж показано на рис. 9-11. Если петля, которую вы изучаете, представ лает собой отдельную единицу транскрипции, то как будет проис ходить мечение петли: постепенно, как в случае больших петен (рис.
9-!0), или одновременно по всей длине, как в петлях мень щего размера? Рас. 9-!2. Р ный цри ан гнбрнднзац хромосом ( (Р) (задача обозначаю у менты ДН1 качестве зо, менты изуч щей длину .' фрагмент 2 генома, он ровки коли ного на гоу 9-14 Гигантские политениые хромосомы ОгояорЫ!а те!апойаугег давая привлекают внимание генетиков, потому что характерная для нн исчерченность создает различимую глазом карту генома.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
