Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 38
Текст из файла (страница 38)
ствуют два ядра. Ядро меньшего размера (микронуклеус) содержит основную копию хромосом клетки. Мнкронуклеус участвует в половой коныогации, но не в постоянной экспрессии генов. Ядро большего размера (макронуклеус) содержит «рабочую» копию клеточного генома в виде большого числа двухцепочечных фрагментов ДНК размером в один геи (мини-хромосомы), которые активно транскрибируются. Мини-хромосомы, содержащие гены рибосомной РНК, представлены большим числом копий, их можно отделить от остальных мини-хромосом путем центрифугирования в градиенте плотности и подробно изучить.
По данным электронной микроскопии каждая рибосомиая мини-хромосома представляет собой линейную молекулу размером 21 т,п.н. При гель-электрофорезе рибосомные мини-хромосомы также мигрируют как молекулы размером 2! т. и. н. (рис. 9-1, дорожка 1). Однако если мини-хромосома разрезается рестриктазой Вя1П, то размеры двух получающихся фрагментов (13,4 и 3,8 т.п.н.) в сумме меньше 2! т.п,н. (дорожка 2). Если обработать ДНК другими рестриктазами, то размеры фрагментов в сумме всегда будут меньше 21 т. п. н.
Более того, суммы величин фрагментов, полученных при обработке разными нуклеазами, различны. Если неразрезанную мини-хромосому до нанесения на гель денатурировать и затем ренатурировать, то фрагмент размером 21 т. п. н. заменяется иа двухцепочечный фрагмент, длина которого точно равна половине исходной молекулы-10,5 т.п.н. (дорожка 3), Сходным образом после обработки Вл1П, денатурацни и ренатурации фрагмент размером 13,4 т.п.н.
заменяется фрагментом вдвое меньшего размера — 6,7 т.п.н. (дорожка 4). Объясните, почему сумма размеров фрагментов, полученных прн рестрикции, не равна 21 т.п. и, и почему подвижность полос меняется при денатурании и ренатурации ДНК. Какова может быть, по вашему мнению, общая организация последовательностей в рибосомной мини-хромосоме? 130 Глава 9 Рис.
9-2. Строение искусственной линейной хромосомы, в которой между теломерами Тежаьутепа заключенм последовательности дрожжевой и бактериальной ДНК (задача 9-4). Указаны единичные сайты разрезания тремя рестрнктазами. Рис. 9-4. ( мнни-хрох ради оактн ДНК-полз Рибосомн~ ннкубирох личных кс как указах ВатН1. П разделяли фореза и ~ автографн рованных дрожжах? Ф ь е ф Ф чт 4ъ 4Ъ ье 4 +- 9,4 м в,я с- 4,4 ма,з -г,о Рис.
9-3. Радиоавтограф рестрик- тов нлазмндной ДНК (задача 9-4). Маркерные ДНК, размер фрагмен- тов которых известен, приведены справа (в т. и, н.). 9-4 А. ез е ~Ь ф 4 ху е — — евнзгз — а ф' хл нрн втен втм Вы придумали хитроумный способ создания мнни-хромосо у дрожжей. Вам известно, что при расщеплении рнбосомных ген~ Тезгнлутела рестриктазой ВашН! образуется фрагмент размера 1,5 т.п.н., содержащий теломеру. Вы хотите соединить тап фрагменты с каждым из концов линеаризованной дрожжеве плазмиды и надеетесь, что после этого плазмида будет сущссти вать как линейная молекула — мини-хромосома.
В качестве плазмидной ДНК вы используете кольцевую плк миду дрожжей, содержащую точку начала репликации дрожи~ (АВЯ1), маркерный ген Е.Е()2, по которому можно провести отбв на основе роста дрожжевых клеток, и последовательности бакт риальной плазмиды рВК322 (рис. 9-2). Вы линеаризуете плазми~ размером 9 т.п.н. с помощью рестриктазы В81П, которая разрез ет эту плазмнду только в одном месте. Затем вы инкубируе линейную плазмнду с фрагментами размером 1,5 т. п. н., иссушив теломеру Теста)хутева, в присутствии ДНК-лигазы н двух рестри таз — Вб!П н ВашН1. При анализе продуктов лигирования в обнаруживаете (кроме исходных компонентов) молекулы рази ром 10,5 н 12 т.п.н.
Вы выделяете фрагмент размером 12 т.пз и вводите его путем трансформации в дрожжи, после чего пров дите отбор на клетки, экспрессируюшие маркерный ген в состн плазмиды. Чтобы определить, какая это плазмида, линейная или колы вая, вы выделяете из трансформантов общую ДНК, обрабатыи ете препараты рестриктазами Нра1, РтнП и Ртн1, разделяе фрагменты в геле и проводите их блот-гибридизацию с радиои тинной ДНК рВ)(322. Схема радиоавтографа представлена ~ рис. 9-3. Как по результатам анализа, представленным на рис.
9-3, рази чить линейную и кольцевую формы плазмиды в трансформ Объясните, почему лигирование фрагментов ДНК в присутств~ рестриктаз ВашН1 и В8П! обеспечивает получение пренмушесзва но мини-хромосомы нужной конструкции. Последовательнося узнаваемая В81П,— это — А*ОАТСТ вЂ”, где знаком * отмечен сн разрезания; последовательность, узнаваемая ВашН1,— и — ОвОАТСС вЂ”. Точная структура теломер полностью не определена ни для одна организма.
Наиболее подробно изучены теломеры, локализови ные на концах рибосомных мини-хромосом. Для расшифровки т структуры большое значение имеют следующие наблюдения. 1. Если рибосомные мини-хромосомы инкубировать с ДНК-пои меразой в присутствии зтР-бСТР и трех других немечевв д)ЧТР (дезоксинуклеозидтрифосфатов), то концевые фрагмевт длиной 3,8 т.п.н., полученные при обработке рестрнктан' ВапзН1, метятся гораздо сильнее, чем центральный фрагмеи содержащий 13,4 т.и.н.
(рис. 9-4, дорожка 8). При инкубака с одним из с))ЧТР включение наблюдается лишь при испольн ванин зтР-с)СТР (сравните дорожку 1 с дорожками 2 — 4). Вкл( чение ЙСТР в присутствии дАТР было значительно бои' высоким, чем включение при инкубации только с с(СТР (4 дорожку 5 и дорожку 1).
Включение с1СТР в присутствии бС)) Клеточное ядро 131 Рвс.94, Строение рибосомной нанн-хромосомы (А) и включение рниоахтввномеченных иуклеотидов ДНК-волимеразой (Ь) (задача 9-5). Гнбосомные мини-хромосомы ннкубироаали в присутствии раз- хнчннх комбинаций нунлсотидоа, мк указано, и затем обрабатывали ВаиНК Полученные фрагменты рннеляли с помощью гель-электро- фореза и выявляли методом радио- мтографии. влмн~ в мн~ Теломвра Теломвра ом еов ом кие >ои во. Меченый ЕНТР С А Т О С С С С С кей юр тегду заете ик.
вн но . Н. во- вне Немоченый ОНТР аатр енто ОТТР ДНК-лигаза 13,4 3,8 2 3 4 а е > 8 о це" ва. ете ак. на >НИ ен. ть, гйт >то >го аи. ьп гой НТ, ши зо. ср) ТР или йТТР не превышало включение в том варианте, где присутствовал только ИСТР (дорожки 6 и 7). 2. Предварительная инкубация мини-хромосомы с ДНК-лигазой практически не влияет на включение в концевые фрагменты, но приводит к снижению в десять раз включения в центральный фрагмент (дорожка 9). 3.
В присутствии трех других немеченых е1ХТР з>Р-г)СТР вклн>чается в тандемно повторяющуюся последовательность 5'-ССССАА — -3'. 4. Мини-хромосомы, меченные только з>Рч)СТР, при денатурации образуют одноцепочечные фрагменты, состоящие из 2, 3 или 4 тандемно повторенных последовательностей ССССАА. 5. Если свободные 5'-фосфаты (не образующие фосфодиэфирной связи) в мини-хромосомах замещают мечеными фосфатами, а затем обрабатывают так, чтобы все связи с пуриновыми нуклеотидами разрушились, то основным меченым фрагментом становится ССС.
6. Если мини-хромосому разрезать рестриктазой А1н1, которая расщепляет ее в участках, расположенных очень близко к концам мини-хромосомы, то прн электрофорезе образуется очень растянутая полоса, содержащая концевой фрагмент. Ведущий край этой полосы соответствует длине фрагментов около 360 п.н., а край, движущийся медленнее,-фрагментам длиной примерно 520 п.н. 7. Синтез ДНК, начинающийся внутри тандемных повторов ССССАА, перемещается постепенно в направлении центра мини-хромосомы. А. Является ли число повторов ССССАА, входящих в состав тело- меры, фиксированным или оно меняется? Дийти минимальную и максимальную оценку числа повторов и объясните ход ваших рассуждений.
Б. На каком конце каждой из цепей мини-хромосомы находятся 132 Глава й Б. Все ли экзоны гена ~3-глобина человека гомологичны экзонам гсв В-глобина мыши (рис. 9-5, Б)? Выявите и поясните все различи В. Существует лн гомология между генами ~3-глобинов мыши и чело Г. Подвергалась ли длина интронов в каждом из этих гена ля и М х х ог 'хй ° х и 5' з Ген 5-глобина человека 12052 нуклеотиде) х о с 5' гвн б.глобина человека Рнс. 9-5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
