Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Эхектрсфорез проводили а хааакряяамвцвом геле с ДСН, х котором белки разделшотся иа основе ях размеров, так что белки с более низкой молекулярной массой оказываются вальша от старта. Оариастии В ОТСУТСТВИЕ микуосом Притеам - + + ся :н, ы. на вь й. их ов 1 2 3 4 6 6 7 В п- от экспериментальным критериям: 1) зашишенность вновь синтезированного белка от экзогеино добавляемых протеаз и незащищенность от протеаз в присутствии детергентов, используемых для распюрения защитного липидного бислоя; 2) гликозилирование вновь синтезированных белков олигосахаридтрансферазами, локализованными исключительно в просвете ЭР; 3) отшепление сигнальных пептидов сигнальной пептидазой, которая тоже активна только на поверхности мембраны ЭР, обращенной в просвет ЭР.
Вы хотите использовать эти критерии, чтобы выяснить, переносится ли синтезированный на очищенной мРНК белок через микросомную мембрану. Для этого вы транслируете мРНК в белок в бесклеточной системе в присутствии микросом и без них. Затем вы проводите опыт в 4 вариантах: 1) без обработки; 2) добавление протеазы; 3) добавление протеазы и детергента и 4) разрушение микросом и добавление эндогликозилазы Н (андо-Н), которая отщепляет )ч-связанные сахара, соединенные с ЭР.
Электрофоретическпй анализ этих препаратов показан на рис. 8-10. А. Объясните экспериментальные результаты для вариантов, в которых микросом в инкубационной среде не было (рис. 8-10, дорожки 1-4). Б. Используя три критерия, перечисленные в этой задаче, решите, указывают ли данные, полученные в вариантах, где были добавлены микросомы (рис.
8-10, дорожки 5 — 8), на то, что белок переносится через микросомную мембрану. Объясните перемещение белков, соответствующее дорожкам 5„6 и 8. В. Заякоривается ли белок в мембране илн полностью переносится через несу ся ю~г- ой ет ~и, от ла ок л- Участии 1В, к~с. нииянимыикти схитри««и» ад а- д иУНК Рас,641. Схема клонароаанвото шв яая изучения сопряжения туааслявш я травслокацяи (задача Ейб). Коавруюшие последователь- вкта ям белков находятся а цре- Иахх большого прямоугольника; ауоыотеряая последовательность— х имсньком прямоугольнике слева. Мыта расщепления матрицы фер- шатаыа рестракцвв указаны пуажвиа.
Под картой гена изоб- .раж«и трв молекулы мРНК вЂ” про- "йвты транскрипции по-развому чааивхеяаых матриц. ие ут ь|ш 8-26 Поступление секреторных и мембранных белков в просвет ЭР, как правило, прочно сопряжено с белковым синтезом. Котрансляционный характер переноса (транслокации) у эукариот дает возможность применять чувствительный и специфический способ изучения ранних этапов биосинтеза этих белков.
Однако это же создает серьезную трудность при выяснении механизма переноса. Например, в такой сопряженной системе трудно определить, «проталкивают» ли рибосомы белок сквозь мембрану, или он «протягиваетсш> через нее за счет механизма переноса. С целью разобщить трансляцию и транслокацию вы осуществили клонирование гена в плазмиде рядом с промотором для РНК-полнмеразы бактериофага (рис. 8-11), Такое расположение позволяет получить транскрипцию гена ш уйто при добавлении 114 Глава 8 Микпосомы добаал сны посла транспнцин Трансляция в присутствии микросом Микоосомы добавланы посла трансляции Трансляция в присутствии микросом Рве.
8-13. 1 вающих мс ках, котора мембрану угольцикаы менты, а с' цоляцсцтиг ются сцгца Трансляция Микросомы в присутствии добавлены микросом посла трансляции Протаааа Эндо -Н и Короткая мРНК В длинная мРНК Б Сродни я мРНК 1 2 3 4 б б 1 2 3 4 5 В 1 2 3 4 б б Б В Г Рве.
8-12. Результаты опытов цо изучению сопряжения трансляции ц трааслокацик (задача 8-26). Показаны результаты с короткой (А), средней (Б) и длинной (В) мРНК. Варвацт обработки образ- цов перед злектрофорезом указан ввд схемой геля. Эцдо-Н удаляет сахара, присоединенные к белкам в ЭР. фаговой РНК-полимеразы.
Кроме того, путем разрезания плазмх ды в разных сайтах внутри гена вы можете создавать боле короткие мРНК по сравнению с нормальными (рнс. 8-11). Ву приготовили три мРНК, показанные на рис. 8-11, и провели ю трансляцию ш уйго. В одном варианте опыта вы добавили микро сомы до начала трансляции. Во втором варианте вы добавил микросомы после завершения трансляции (вместе с цндлогекснмв дом, нужным для подавления любого дополнительного белковоп синтеза).
Чтобы выявить транслокацию, вы обрабатывали некого рые пробы протеазой либо разрушали микросомы и проводив обработку эндоглнкозидазой Н (эндо-Н), а затем с помощьа гель-электрофореза с ДСН выявляли образовавшиеся продукту (рис. 8-12). Переносятся лн белки от каждой мРНК в микросомы, когд трансляция происходит в присутствии микросом? Удалось ли вам получить разобщение транслокации и трансляци в каком-нибудь из вариантов? Объясните ваш ответ. Подтверждают ли полученные результаты идею о том, что рибд сомы проталкивают белки сквозь мембрану ЭР, или же ои указывают на то, что белки протягиваются через мембрану благу даря механизму переноса? Почему перенос более коротких белков может происходить неи внсимо от трансляции, а перенос более длинных белков--нет? Хотя точный механизм котрансляционного встраивания белке в мембраны не известен, можно предсказать окончательное расла ложение белка в мембране, если известны его сегменты, пронизь вающие мембрану.
Если пронумеровать эти сегменты с )ь(-концу то нечетные начинают транслокацию (действуя, как пептнду «начала переноаьту), а четные заканчивают ее (действуя, как пепи ды «конца переноса»). Далее, поскольку пептнды погружаюта в мембраны, как шпильки в волосы, пептиды начала перепое ориентируются своими Х-концами в сторону цитоплазмы,1 С-концами — к просвету ЭР. Благодаря такой ориентации сегмеь тов начала переноса фиксируется противоположная ориентацв сегментов конца переноса, так что их )ь1-концы направлены в суь. рону просвета ЭР, а С-концы — к цитоплазме. На рис. 8-13 схематически изображены четыре мембранни белка. Прямоугольниками изображены сегменты, проннзывающк мембрану, стрелки указывают места отщепления лидерных пента Рве. 8-14. дов.
Предскажите на основе описанного выше механизма котравь бранного Внутрнклеточная сортировка макромолекул 118 Рве.843. Распределение пронизы- ееюгцих мембрану сегментов в бел- ям, которые нужно встроить в иеибрану ЭР (задача 8-27). Прямо- )гояьяиками изображены зти ссг- иситы, а стрелками указаны места юляпснтидной цепи, где отщепля- ются сигнальные пептиды. 4 С сс Ы гх о" 1И и о о зи Ю Ы ляционного встраивания, каким образом каждый из белков будет располагаться в мембране ЭР.
Укажите, как ориентированы Х- и С-концы по отношению к питоплазме и просвету ЭР. ов 10. ,ыца; .О+ $ г 0 '18" '844. График гидропатнн мсм- О) О го белка (задача 8-28). 50 100 150 200 250 Номер еминониеиогы е попнпоптианой цепи 8-28 Вас заинтересовало, что расположение белка в мембране в принципе может определяться самой последовательностью аминокислотных остатков.
График гидропатии аминокислотных остатков вдоль цепи можно использовать для идентификации гидрофобных областей, которые, вероятно, соответствуют сегментам цепи, пронизывающим мембрану. На основе правил котрансляционного встраивания вы могли бы предсказать, какие участки белка будут выступать в цитоплазму, а какие — на поверхность клетки. Вы хотите проверить свои предположения иа Е. со)1', объекте, позволяющем привлечь для решения проблемы мощные средства генетического анализа. В качестве тестового белка вы выбираете мембранный белок с известной аминокислотной последовательностью, который клонируете с помощью плазмиды. График показателя гидропатии этого белка представлен на рис.
8-14. Вы хотите проверить свои предсказания, получив гибридные белки, которые состоят из мембранного белка на )ь)-конце и щелочной фосфатазы на С-конце. Щелочную фосфатазу легко определять в целых клетках, и в ее молекуле нет сколько-нибудь протяженных гидрофобных участков. Более того, когда она локализована на цитоплазматической стороне мембраны, ее активность низка, а когда она располагается на внешней стороне мембраны (в периплазматнческом пространстве), ее активность высока.
116 Глава 8 Кпиаартииип ппаамид за С::жпйззййийЗВИ ВЫСОКАЯ ав 2 Ц:::;:::;::йзйзнййй~й ВЫСОКАЯ юв низкая аз1 НИЗКАЯ 226 ВЫСОКАЯ 21О ВЫСОКАЯ иод«ям«при»аидам ппаамидм высокая высокая низкая зао низкая 1се Ж й ВО 8-29 ЫВ е ВО ий ае ий 20 с о о,в ьо ьв Врамп, а Рве. 8-16. Перенос меченого ФХ от донорных веэикул к мембранам эрятроцитов с помощью белка— переносчика ФХ. Рас. 8-15. Структуры гибридных белков для проверки предскаэаняй о расположения белков в мембране, сделанных на основе данных по гялропатяя (задача 8-28). Мем- бранный белок (незаштряхованкый сегмент) расположен у )Ч-конца, а щелочная фосфатаза (заштрихо- ванный сегмент) — у С-конпа гиб- ридной молекулы.
Участки амяяо- кислот, отсутствующих в моди- фицированных гибридных белках, указаны перевернутыми Ч-сбры- ными знаками. Ближайшие к С- концу аминокислоты мембранного белка пронумерованы. Активность щелочной фосфатазы для каждого гибридного белка указана справа. Вы вьщеляете шесть гибридных белков, состоящих из разлш ных фрагментов мембранного белка и щелочной фосфатазр Структуры этих белков (с указанием номера для С-концева аминокислоты мембранного белка) и уровень активности щелоа ной фосфатазы (высокая или низкая) представлены на рис. 8-1! В качестве дополнительного теста вы используете два удобв расположенных участка рестрикции в гене для мембранного белю чтобы получить делецни фрагментов, с которыми удаляюта ходоны для аминокислот от номера 68 до номера 103.
На рис. 8-1 эти модифицированные плазмнды также представлены. А. Какое расположение белка в мембране можно предсказать в данным графика гццропатии на рис. 8-14? Насколько оно совпаи ет с результатами, полученными на гибридных молекулах? Б.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
