Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Когда вы показываете схему опыта руководителю, она с воод1 шевлением одобряет ваш план, однако отмечает в нем существеь цый недостаток, который может помешать выделению мутанте по транспорту в ядро. Подсказывать руководитель не хочет, Оь считает, что студенты лучше овладевают предметом, когда дейа вуют самостоятельно. 8-13 что какие-то другие типы мутантов (не имеющих отношенз к ядерному транспорту) смогут выжить при данном спосо1 отбора? А.
В чем заключается основная ошибка в плане эксперимента? Б. Как следует изменить план, чтобы исправить недостаток? В. Если действовать по исходному плану, то можно ли подозрева~ Внутриклеточнал сортировка макроьюлекул 107 кяй ал Б1 >и: ж>р" >й. и>в, ре ут >ет >м, >ть ми гь, чеки, :но ты >ие яв- му >та Гы, >не >ие азих Вы ,ер>ый ках иб, за рена >татра 'ду >еитов Эна >ст- >ть, них обе Транспорт белков в митохондрии и хлоропласты (МБК 8.4) Укажитс, какие из следующих утверждений правильные, а ка- кие-нет.
Если утверждение неверно, объясните почему. Относительно немногочисленные белки, закодированные в гено- мах митохондрий и хлоропластов, локализованы в основном во внутренних мембранах этих органелл. Митохондриальные сигнальные пептнды представляют собой ам- фипатические а-спиральные структуры с положительно заряжен- ными аминокислотными остатками на одной стороне и отрица- тельно заряженными аминокислотными остатками на другой сто- роне спирали. Движущей силой процесса встраивания митохондриального сиг- нального пептида в наружную митохондриальную мембрану во время проникновения белка-предшественника в митохондрию слу- жит, по-видимому, электрохимический протонный градиент. Поскольку М-конец импортируемого белка может расщепляться протеазой матрикса, а его С-конец доступен для действия наруж- ных протеаз, белки-предшественники, по-видимому, проникают через наружную и внутреннюю мембраны одновременно.
Свернутое состояние пептидной цепи белка характеризуется более низкой свободной энергией, чем развернутое, поэтому разворачи- вание молекулы белка при переносе его в митохондрию связано с затратами энергии. Белки, предназначенные для внутренней митохондриальной мем- браны, по-видимому, проходят через наружную и внутреннюю мембраны в матрикс, а затем встраиваются во внутреннюю мембрану. Поскольку в наружной мембране митохондрий имеются очень крупные поры, она не является преградой для белков, Как в хлоропластах, так и в митохондриях движущей силой транспорта белков-предшественников через наружную и внутрен- нюю мембраны служит электрохимический протонный градиент.
8-15 Г. 8-16 Изучая импорт белков в митохондрии, вы обрабатывали клетки дрожжей циклогексимидом, блокирующим движение рибосомы по мРНК. При исследовании этих клеток с помо>цью электронного микроскопа вы с удивлением обнаруживаете, что цитозольные рибосомы прикреплены к внешней поверхности митохондрий. В отсутствие циклогексимида прикрепленных рибосом никогда не наблюдалось. Чтобы выяснить причину этого явления, вы препаративно выделяете митохондрии из клеток, обработанных цикло- 8-14 Заполните пропуски в следующих утверждениях.
А. В митохондрии имеется четыре внутренних компартмента: (в направлении изнутри наружу). Б. В хлоропластах имеется два дополнительных внутренних компартмента: и В. Белки цитозоля, предназначенные для импорта в митохондрии, называются Г. Считается, что импорт внутрь матрикса происходит в где внутренняя и наружная мембраны митохондрии, по-видимому, соединяются. Д. В хлоропластах имеется дополнительный, ограниченный мембраной компартмент, называемый 108 Глава 8 В Аминоиислотная послеловатепьность А Спирально-круговая проекция 11 1а д Х 01 Лг Х1 ФЕ Х1 8-17 8-18 В утренняя мамбрвна Наруяиа мембрана Мембрана нлвконва пространство Рве.
8-7. Шесть компартмснтов хлоропластов (задача 8-18). ы ю з Рве. 8-6. Возможные сигнальные полтины для импорта и митохондрии (задача 8-17). А. Спирально-круговая проекция а-спнрали. Числа показывают положения первых 18 аминокислот а-спяраля; аминокислота 19 должна занимать такое жс положение на проекции, что и аминокислота 1. Б. Аминокислотные последовательности трех пептидов. Х-концы расположены слева; гндрофобные аминокислоты показаны серым цвстоян заряд на заряженных аминокислотах указан в кружке сверху; незаряженные гидрофильныс аминокислоты ие имеют дополнительных обозначений. Ю О О9 Ю ЕЩЩк а ЩЩ е ЩЩ о е ЩЩ н т ЩЩ Ю ЮЮ Ю Ю ЩЩЩ н ЩЩ н кЩЩ н ЩЩ т н ЯЩ в Ю Ю Ю Ю Ю н ЩЩ н а н ЩЩ к Щсгр(твбЩ н ЩЩЩ Щ гексимидом, и экстрагируете мРНК, связанную с рибосомамх, прикрепленными к наружной поверхности митохондрий.
Вы транс. лируете эту мРНК ш тйгго и сопоставляете ее белковые продукты с продуктами мРНК из цнтозоля, транслированпой таким жс образом, Результаты четко показывают; рибосомы, связанны1 с мембранами митохондрий, транслируют те мРНК, в которыт закодированы митохондриальные белки. Вы поражены! Подтверждается то, что было хорошо видно на электронных фотомикрографнях: импорт белков в митохондрии происходит во время трансляции.
Как можно соотнести эзи результаты с преобладающей точкой зрения, что импорт мить хондриальных белков осуществляется после того, как синтез зб. кончен и они отделены от рибосом? Основная особенность сигнальных пептидов, используемых длт импорта белков в митохондрии;.это их организация в виде амфв патической спирали. Спираль является амфипазической, если одаб сторона ее гидрофильная, а другая-.гндрофобная. Вопрос о том, может ли данная последовательность аминокислот образоват1 амфипатическую спираль, решается путем расположения аминь кислот вокруг так называемой «спирально-круговой проекцият (рис.
8-6, А). На рисунке изображено положение аминокисль1 вокруг а-спирали (вид сверху). Если на такой схеме гидрофобннт аминокислоты чередуются с гидрофильными, то спираль не явля ется амфипатической; если же гидрофобные аминокислоты распь ложены с одной стороны, а гидрофильные амннокислоты-с прб тивоположной, то спираль амфипатическая. Определите с помощью спирально-круговой проекции, какой и: трех пептидов, изображенных на рис. 8-6, Б, может образовать амфипатическую спираль, способную служить сигналом ди импорта белка в митохондрии. В хлоропластах имеется птесть компартментов; наружная мембрь на, межмембранное пространство, внутренняя мембрана, стромк тилакоидная мембрана, просвет тнлаконда (рис. 8-7); для каждого из них характерен специфический набор белков. Многие из этя1 белков закодированы в ядерных генах. Они транслируются в цито плазме и затем направляются в соответствующий компартмеж хлоропласта.
Чтобы изучить импорт белков в хлоропласты, вб провели клонирование ДНК для ферредоксина (ФД), которьй локализован в строме,и для пластоцианина (ПЦ), который лоеь лизован в просвете тнлакоида. Далее, используя метод рекомбе нантной ДНК, вы сконструировали два гибридных гена: гед кодирующий ФД + сигнальный пептид ПЦ, (ПЦФД) н ген, кодр рующнй ПЦ+ сигнальный пептид ферредоксина, (ФДПЦ). Затеи вы проводите ш уйго трансляцию мРНК от этих четырех генах Ряс. 8-8 и пласт хлороцт обработ (А), а ° методов Каждая в (Б) сс экспери столбце 4, ПРОТОКОЛ ЭКСПЕРИМЕНТА Б, ГЕЛЬ-ЭПЕКТРОФОРЕЗ ФД ФД ПЦ ПЦ дорожка ! ТРАНСПНЦИЛ мРНК !и Ч!ТНО а ДОБАВЛЕНИЕ хлороллдстов е ОБРАБОТКА ПРОТЕАЗОЙ, ПОВТОРНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ ХПОРОППАСТОВ Дорожка 2 Дорожка 3 мн, тнс- ЕРАКЦИОНИРОВЯНИЕ хлоюплдстов ФД ПЦ Пц ФД кты жс ные зых та Внутренние н наружна» мембраны Дорожка 4 Дорожка Б ~ на ню ЭТВ Его.
за Тнлаконды Доро . В Доро»на 7 Тнлаконды + лротема Рве, 84. Импорт ферредоксвна я пввсюдяавнна в компартменты пюрсплвста (задача 8-18). Образцы обработаны как указано в столбце (л), в затем проанализированы неводом гель-элеятрофореза (Б). )(кппя пронумерованная дорожка в(б)соответствует определенной вкперямептальной обработке в столбпе (А).
й нз Гать для Пероксисомы (МБК 8,5) для фн. дна ом, !ать ИЮ! :лот ные вля:поРО. )ра~ма, ;ого ~ТИХ гто!ент вы эый жа- вбнген, тди" тем юв, Внутриклеточнал сортировка макромолекул 109 смешиваете продукты трансляции с выделенными хлоропластами на несколько минут, снова выделяете хлоропласты после обработки протеазой и фракцнонируете их, чтобы установить, в какие компартменты попали продукты трансляции. На рис. 8-8 представлены электрофореграммы этих белков для каждого этапа опыта и каждой фракции хлоропластов. А. Насколько эффективным было поглощение хлоропластами ферредокснна и пластоцианнна в вашей системе пз гйго? Б.
Локализованы ли ферредоксин и пластоцианин в характерных для ннх компартментах хлоропластов? Позволяют ли ваши экспериментальные данные ответить на этот вопрос? В. Импортируются ли гибридные белки в соответствии с вашим замыслом (еслн Х-концевые сигнальные пептиды определяют их конечную локализацию)? Объясните наблюдаемые отклонения от ожидавшегося результата. Г. Почему в опытах с пластоцианином и ПЦФД обнаруживается три, а в опытах с ферредоксином и ФДПЦ-две полосы? Д. Попытайтесь на основании своих опытов предложить модель импорта белков в строму и в просвет тилакоида. 8-19 Заполните пропуски в следующих утверждениях.
А. , которые называются также микротельпамн, сходны с ЭР тем, что представляют собой самореплицирующиеся, окруженные мембраной органеллы, не содержащие собственного генома. Б. Растения, но не животные, могут превращать жирные кислоты в сахара в результате последовательности реакций, называемой ; перокснсомы, в которых эти реакции протекают, называют также 110 Глава 8 Зонд опиго-1 Опиго.2 Опиго 3 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а ка 8-20 Иогоеник иднк ч м ч и ч и тающих. Б. Реакции пероксисомного окисления имеют особое значение в клет.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
