Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 30
Текст из файла (страница 30)
8-2, А. Динамика деградации за весь период отбора проб показана на рнс. 8-2, Б. А. С помощью метода рекомбинантной ДНК можно было бы создать ряд плазмид с измененным первым кодоном гена р)-галактозидазы. Как вы думаете, почему не был использован этот более прямой путь? Б. Оцените период полужизни трех различных видов )3-галактозидаз (время, за которое деградирует половина материала). 8-7 Когда вы узнали о работе, описанной в предыдущей задаче, вас заинтересовали два аспекта представленных там данных. Во-первых, действительно ли убикитин удалялся с Х-конца? Во-вторых, чему соответствуют полосы, расположенные над полосами б-галактозидазы на электрофореграмме (рис.
8-2, А)? Любые фрагменты б-галактозидазы, образующиеся при ее деградации, должны находиться на электрофореграмме ниже полосы ))-галактозидазы, Чтобы проверить, действительно ли В-галактозидаза высвобождается в результате отщепления убикитина от образовавшегося гибридного белка, вы выделяете с помощью антител нерадиоактивную 33-галактозидазу из клеток, содержащих те же три плазмиды. Затем вы подвергаете эти образцы гель-электрофорезу с ДСН, переносите пластины геля на фильтровальную бумагу и проводите реакцию взаимодействия с радиоактивными анти- телами против убикитина. Как видно из рис.
8-3, антитела к убикитину не взаимодействовали с материалом, соответствующим полосе В-галактозидазы. Однако эти антитела взаимодействовали со всеми полосами, расположенными над В-галактозидазой Рас- 104 Глава 8 положение этих полос было таким же, как и расположение полос на рис.
8-2, А. А. Показывают ли эти опыты, что убикитин отщепляется от Х-конца гибридного белка? Б. Почему в случаях, когда на М-конце находились остатки изолейци. на (1) или аргинина (В), убикнтин присутствовал в полосах, расположенных выше полосы б-галактозидазы, а в тех случаях, когда на Х-конце был остаток метионина (М), убикитин нв обнаруживался? вл 8-8 Орнитиндекарбоксилаза (ОДКаза) катализирует первую реакцию в биосинтезе полиаминов, которые связываются с сахарофосфат. ным остовом молекул ДНК и РНК и играют существенную роль в процессах роста клеток. Активность ОДКазы регулируетсь обычно в соответствии с физиологическим состоянием клетки. Представьте, что вы выделили мутантную линию клеток нече. ни с гораздо более высокой, чем в норме, активностью ОДКазы.
Ваши предварительные опыты позволяют предположить, что нор. мальные и мутантные клетки несут одинаковое число генов для ОДКазы, что эти гены транскрибируются с одинаковой скоростью и что нет явных различий в структурных и ферментативньп свойствах ОДКаз из нормальных и мутантных клеток. Однако когда вы добавляете ингибитор синтеза белка, циклогекснмил, и измеряете затем ферментативную активность в разные моменты времени, то обнаруживаете, что ОДКаза из мутантных клетог имеет период полужизни 12 ч вместо 14 мин, как у ОДКазы из обычных клеток.
Период полужизни других белков у мутантно6 линии не изменялся, А. Если ОДКаза образуется с той же скоростью, что и в нормальныг клетках, то почему в мутантных клетках активность этого фермен. та гораздо выше? Б. Каким образом можно было бы определить, чем обусловленя нестабильность ОДКазы в нормальных клетках: разрушением белка нли инактивацией его в результате модификации (например,. фосфорилирования, метилирования или ацетилирования)? В. Предполагая, что нестабильность ОДКазы в нормальных клетках объясняется деструкцией белка, предложите объяснение стабиль.
ности ОДКазы в клетках мутантной линии. т< Рве. ввел и егг схем авто и яд~ мина Транспорт молекул белков и РНК в ядро и из ядра (МБК 8.З) 8-9 Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. окружает ДНК и ограничивает клеточное ядро. Б. Ядро окружено двумя концентрическими мембранамв: мембраной, содержащей специфические белки, кото. рые служат участками связывания прилегающего тонкого ядерно. го слоя, и мембраной, непосредственно переходяще1 в мембрану ЭР. В. В ядре имеются перфорации- , каждая из киторыь встроена в крупную дисковидную структуру, называемую Г.
Селективность транспорта в ядро обеспечивается за счет сигналоь для , которые имеются только в ядерных белках. Рве. 8 8-10 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а ка дован кие — нет. Если утверждение неверно, объясните почему. ней (ь Внуурнклеуоцная сорунровка макромолекул 106 Инъекция Инъекция внутаь ядав в цитаппевму Перинуклеарное пространство непосредственно связано с просве- том ЭР. В области ядерной поры, как и в других местах, лнпндные бислои внутренней и наружной ядерных мембран отделены друг от друга. Поскольку молекулы ядерных белков неоднократно входят и вы- ходят из ядра, их участки узнавания (сигналы) не отщепляются после переноса в ядро. Для переноса белков в ядро необходимы специфические сигналы и затраты энергии (гидролиз АТР), а для выхода РНК и субь- единиц рибосом из ядра, по-видимому, не нужно никаких сигналов или затрат энергии.
Поскольку ядерная оболочка связана с мембраной ЭР, то сжатие или расширение ядра можно легко объяснить перетеканием мембран в ЭР и из него. 0 (') В. х, ае 4 (') (=) ганка адин Г. ю .тль ся й (™) Р Гаеавки ~~,/ Де ( ° ) еы. 'Р ля ю их ко гд, гы ок из ой Рис,$4. Локализации в клетке ииедепиых и нее нухлеоплазмина и гго компонентов (зидача 8-11). Ни ггенитическп изображенных радиомгогрифих показаны цптоплазма и идро.
Локализации пуилеоплазжпв отмечена серым цветом. ых зн- ,на ем ер ах ть- рцъ~ Сит ен паиеутатвует ин: го- но- гей 8-12 Вы приступили к работе в лаборатории, где занимаются изучением механизма ядерного транспорта у дрожжей. Ваш руководитель— сотрудница, известная своими оригинальными идеями,— предложила вам очень перспективный план. Он позволит провести генетический отбор условно-летальных мутантов по механизму ядерного транспорта. Руководитель предоставила вам две плазмиды (схематически изображенные на рис. 8-5). Каждая нз них содержит гибридный ген, находящийся под контролем регулируемого промотора.
Гибридный ген образовался в результате слияния гена, продукт Сигнвп атауга вует юв Рис.8.5. Дие плазмпды для пссле- вяапп грииспорга в ядро у лрож- иий (зидачи 8-12). 8-11 Теоретически белки могли бы накапливаться в ядре двумя путями. 1). Они могли бы проникать в ядро за счет пассивной диффузии и задерживаться там благодаря связыванию с постоянными компонентами ядра, например с хромосомами.
2). Перенос белков в ядро мог бы осуществляться путем активного транспорта, и нх накопление не зависело бы от сродства к компонентам ядра. Провести различие между пассивной днффузией и активным транспортом очень трудно, так как большинство, если не все белки в ядре прямо или опосредованно связаны с ядерными компонентами. Хотя часто утверждают, что физический размер ядерной поры (кажущийся диаметр 9 нм) благоприятствует активному транспорту, однако такую аргументацию нельзя считать удовлетворительной, поскольку форма молекул для большинства ядерных белков неизвестна. В одном нз экспериментов, проведенном для разрешения этой проблемы, использовали радиоактивный нуклеоплазмин.-крупный пентамерный белок, участвующий в сборке хроматнна, а также составляющие его элементы.
В разных вариантах опыта в цито- плазму или в ядро оопита лягушки были инъецированы: натнвный белок, «головки» молекулы, «хвосты» молекулы и головки плюс один хвост (рис. 8-4). Все элементы молекулы нуклеоплазмина, кроме головок, накапливались в ядре, если были введены в цито- плазму, н все они оставались в ядре, если были введены в него. А. Какая часть молекулы нуклеоплазмина ответственна за его локализацию в ядре? Б.
Каким образом с помощью этих опытов можно определить механизм переноса: активный ли это транспорт, который запускается сигналом для переноса в ядро и идет через поровый комплекс ядерной оболочки, или же пассивная диффузия, при которой накопление белка в ядре происходит за счет связывания с компонентом ядра 10Б Глава 8 Таблица 8-1. Результаты опытов по выращиванию дрожжей, несущих плазмнды РХ1 ' нлн рХ1, (задача В-121 которого нормально импортируется в ядро, с геном для рестриктазы Есорх1, В плазмиде рХ(.' закодирован функциональный сигнал для ядерного импорта, а в плазмиде рХ(. — тот же сигнал в нефункциональной форме.
Промотор из дрожжевого гена СА?.1 обеспечивает транскрипцию гибридного гена при особом условия в среде для культивирования должна быть галактоза. Следуя советам руководителя, вы ввели эти плазмиды в дрок. жи (в отсутствие галактозы), а затем исследовали рост трансфор. мированных дрожжей на среде с глюкозой и на среде с галактозой. Результаты эксперимента представлены в табл. 8-1. Вы не помни.
те, что говорила руководитель по поводу ожидаемых результатов. но знаете, что от вас ждут сообщения на лабораторном семинарь в конце недели. Почему дрожжи с плазмидой А~И.' растуз в присутствии глюкозы, но гибнут в среде с галактозой? Плаз- мила Среда с з люкозой Среда с галакгозой РХс+ Рост Гибель РХ1 Рост Рост Когда вы поняли, почему плазмида р1~П. (рис. 8-5) вызываез гибель клеток в среде с галактозой, для вас становится ясным каким образом ваш руководитель намеревается использовал свойства этой плазмиды для отбора мутантов с изменениямз в механизме ядерного транспорта.
Вы начинаете также понимать, почему она подчеркивала, что мутанты должны быть услокно-ле тадьными. Поскольку ядерный транспорт необходим для клетка полностью дефектный мутант не смог бы расти и его невозможаь было бы исследовать. Напротив, условно-летальные мутанта могут хорошо расти при тех или иных условиях (разрешающи условия); при других условиях (ограничивающие условия) проке ляется дефект клеток, который можно тогда исследовать. На основе этой общей стратегии вы разрабатываете схем1 отбора клеток, мутантных по механизму ядерного транспорп и чувствительных к температуре (ьа), Вы хотите найти мутанты которые хорошо растут при низкой температуре (разрешающи условия), но плохо — при высокой температуре (ограничивающи условия). Вы планируете индуцировать мутации в клетках с плах мидой рХ1.~ при низкой температуре, а затем перевести и в условия высокой температуры и среду с галактозой.
Вь считаете, что прн ограничивающей температуре мутанты по ядер ному транспорту не будут поглощать белок-убийцу, кодируемы плазмидой рМ.+, а потому не погибнут. В нормальных же клетке будет происходить транспорт белка-убийцы в ядро, и они погя1 нут. После инкубации в течение 1 — 2 ч при высокой температуре, з время которой нормальные клетки должны погибнуть, вы намерь ваетесь понизить температуру и поместить выжившие клетки а' пластинки питательного агара, содержащего глюкозу. Вы полап ете, что мутанты по ядерному транспорту реактивируются пр низкой температуре и дадут колонии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
