Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 35
Текст из файла (страница 35)
А. Между какими двумя компартментами аппарата Гольджн исследовалось движение белков в этом эксперименте? Объясните ваня ответ. Б. Если бы белки продвигались по аппарату Гольджн за счет образования цистерн, то какие результаты можно было бы предсказать для описанного здесь эксперимента? Если бы белки проходили через аппарат Гольджи в транспортных везикулах, то каковы тогда были бы результаты? В. Какую из этих двух моделей подтверждают результаты опыта, представленные в табл.
8-2? 8-33 Вы получили несколько линий мутантных клеток, дефектных по способности присоединять углеводы к экспортируемым белкам. Используя белок, содержащий только )х)-связанные сложные олигосахариды и легко поддающийся очистке, вы проанализировали состав этих олигосахаридов в клетках разных мутантов.
Оказалось, что все мутанты различаются по качественному и количественному составу олигосахаридов (табл. 8-3). А. Расположите мутанты в таком порядке, который соответствует этапам процессинга )ч)-связанных олигосахаридов. Б. Какие из мутантов дефектны по процессингу,проходящему в ЭР, а какие †процессингу, проходящему в аппарате Гольджи? В. Какие из мутантов вероятнее всего дефектны по ферменту процес- синга, непосредственно отвечающему за модификацию Х-связанных олигосахаридов? Какие мутанты могут быть дефектными не по ферменту процессинга, а скорее по другому ферменту, затрагивающему процессинг олигосахаридов лишь косвенно? 8-34 О-белок вируса везикулярного стоматита (ЧБЧ) — это типичный мембранный гликопротеин.
Кроме сигнального пептнда, отшепляемого после попадания белка внутрь ЭР, в его составе есть также единственный сегмент, пронизывающий мембрану. С помощью него О-белок удерживается в плазматической мембране, так что 120 Глава 8 Дикий тцп Мутант А Мутант В Мутант С Мутант (3 Мутант Е Мугазгт Р Мутант О Мутант Н Мутант 1 Сегмент, пронцзывнощна мембрану рм$15 раю15 рма14 551А 5515 551А 5РРР11 — — — — — -Р ьчь ьчь ьчь рМН12 5РРР1 Рве.
8-18. Пронизывающие мем- брану домены О-белков нз нор- мальных ц мутантных вирусов ЧБЧ (задача 8-34). В номерах плазмнд отражено число аминокислот в сег- ментах,пронцзывающнх мембрану; например, рМ820 означает: дякнй тяп, в сегменте содержнтся 20 аминокислот. Штриховыми линия- мн обозначены аминокислоты, отсутствующие в результате мута- ций. Буквы в прямоугольниках обозначают основные амннокнсло- ты на концах сегментов, пронвзы- вающих мембрану. Таблица 8-3. Аналнз сахаров, содерхгащнхся в )з(-связанных олнгосахарндах яз клеток дикого типа ц нз клеток мутантных линий, дефектных цо цроцессннг! олнгосахарнлов (задача 8-33) Клеточная ланца Мац ОЫЧАс О51 1(А)ЧА Ис Сокращения: Мап — мявпозя; О!птзлс-ВЬяцетелгпюхоьзмва; Оа! — галакгеза; г!А(ЧА — Н. ацетцпнеарамвнояая янслста (сналовая янслста); яс — глюкоза. Цпфрамв указано число мопсмеров соотяетствующц.о сахара в данном слнгосазлрвпе.
его короткий С-концевой домен оказывается в цитоплазме, а го. раздо более крупный, )з(-терминальный домен выступает с нарул. ной стороны клетки. Трансмембранный сегмент состоит из 3 незаряженных и преимущественно гидрофобных амннокислотньц остатков, к которым с обоих концов примыкают остатки основньп аминокислот (рис. 8-18). Отрезка полипептидной цепи из двадцатх аминокислот, образующих а-спираль, как раз достаточно дзп пересечения липидного бислоя толщиной 3 нм. Чтобы проверить, какой длины должен быть сегмент, прона.
зывающий мембрану, вы модифицируете клонируемый ген О-бел. ка, чтобы получить ряд мутантных белков, у которых этот сегмезц короче (см. рис. 8-18). При введении модифицированных плаз мид в культивируемые клетки каждый мутантный ген практичеаа не отличался по уровню экспрессии от гена дикого типа. Вк анализируете распределение измененных О-белков внутри каста несколькими способами. 1. Вы выясняете локализацию модифицированных О-белков 1 клетке с помощью метода иммунофлуоресцентной микроскс. пии, используя специфичные к О-белкам антитела с флуорсс. центными маркерами.
Б 5 1 А 5 Р Р Р 1 1 0 Ь 1 1 0 Ь Р Ь Ч Ь Б 5 1 А 5 Р Р Р 1 1 0 Ь вЂ” - 0 Ь Р Ь Ч Ь Б Б 1 А Б Р Р Р 1 1 0 ---- Ь Р Х Ч Х >з 'у РМЯ20 Плазматичсскап мембрана — Э- Устойчив Чувствителен рМЯ18 рМЯ16 рМЯ14 рМЯ12 рМЯ8 РМЯΠ— »в -Э- -»в -Э- †»вЂ” -Э- †»- Внутри клетки Внутри клетки Внутри клетки — Э+/ — Устойчив Чувствителен Чувствителен — » Устойчив в 3- 1- 1т з:и Ы сч Внугрннлеточнал сортировка макромолелул 181 2.
Вы характеризуете присоединенные цепочки олигосахаридов, воздействуя на О-белхи эндогликозидазой Н (эидо-Н), которая отщепляет только те Х-связанные олигосахариды, которые не доспи.ли определенной стадии процессинга в аппарате Гольджи (см. МБК, рис. 8-63). 3. Вы определяете, сохраняется ли короткий С-концевой пдтоплазматический домен (который характерен для нормального белка) в измененных О-белках, для чего обрабатываете выделенные микросомы протеазой.
У нормального О-белка этот домен при обработке отщепляется. Результаты этих экспериментов суммированы в табл. 8-4. Твблнпа 8.4. Результаты опытов, характеризующих распределение О-белков в нормальных и мутантных клетках (задача 8-34) Плазмида Леналнзмим в клспсе Обработка андо-Н Обработка иро>еам>й Примсчаниа: Символ +/ — в колонке «Обр«бстх«эндо-Н» означает, что только 30% О-белха было чувствительно «фсрм«нту»ндс-Н; другие мсдифвпнрсваввые О-бслхн емли либо полностью устойчивы, либо полностью чувствлт«льны. В холопке «Обрабстха прот«азой» термин «Чувствлт«лею> с»в«ча«т, чгс «срсгхнй С-холл«вой домен уд«л«сгая при обработке ф«рм«втсм.
Термин «Устсйчвв» указывает, что мол. масса С-б«лха не изм«нлл«сь прн обработке. А. Насколько позволяют эти данные, определите внутриклеточную локализацию каждого измененного О-белка, который не может достичь плазматической мембраны. Б. Какова минимальная длина пронизывающего мембрану сегмента у О-белка ЧЯЧ, достаточная для закрепления белка в мембране? В.
Какова минимальная длина пронизывающего мембрану сегмента, необходимая для правильной сортировки О-белка? Транспорт белков из аппарата Гольд?ки В лизосомы (МБК 8.8) 8-35 Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. — это ограниченный мембраной мешок с гидролитическими ферментами, предназначенными для регулируемого внутриклеточного расщепления макромолекул. Б. Гидролитические ферменты, активные при низком рН, называются В. Компартмент, в который поступают новосинтезированные лизосомные гидролазы и мембранные белки из аппарата Гольджи, называется Г. Деградация отработанных частей клетки может происходить путем , прн которой мембраны, происходящие из ЭР, 122 Глава 8 замыкаются с образованием особой органеллы, , сля вающейся затем с лизосомой. Клетки, специализированные для фагоцитоза, могут поглощат. микроорганизмы, образуя которые после слиянв с лизосомой превращаются в Наиболее серьезная из болезней, связанных с нарушением локали зации лизосомных ферментов,— это очень редкое заболеванк~ называемое , при которой гидролазы полностью нахо дятся вне лизосом.
Д Е Г. И. 8-37 Больные с синдромом Гюнтера или синдромом Херлера редк доживают до 20 лет. Анализ показывает, что в их лизосокя накапливаются гликозаминогликаны вследствие утраты спецяф~ ческих лизосомных ферментов, необходимых для их деградаци Если вызывали слияние клеток от больных с одним синдрома с клетками от больных с другим синдромом, то в лизосомя гибридных клеток гликозаминогликаны деградировали норман ным образом, следовательно, у разных больных были утрачев разные ферменты деградации. Даже если такие клетки прхз культивировали вместе, они исправляли дефекты друг друа Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а хг кис — нет. Если утверждение неверно, объясните почему.
В лизосомной мембране действует протонная помпа, использ) ющая энергию гидролиза АТР для того, чтобы выкачивать х лизосомы протоны и тем самым поддерживать в ее полосв низкий рН. Лизосомы — это разнообразные по форме и размерам органеллв присутствующие во всех эукариотических клетках, т.е. в клетка обладающих ядром. Эндолизосомы превращаются в зрелые лизосомы в результат утраты компонентов эндосомной мембраны и дальнейшего сикха ния внутреннего рН. Материал, поглощенный путем эндоцитоза, сразу попадает в лиз~ сомы, где его компоненты могут разрушаться до небольшв молекул.
Лизосомные гцдролазы маркируются для направления в лизосом группами маннозо-6-фосфата (М6Ф), которые присоединяюте к их Х-связанным олигосахаридам в полости аппарата Гольдю Если обработать клетки таким слабым основанием, как аммоня или хлороквин, которые повышают рН внутри органелл я нейтрального, то рецепторы М6Ф будут накапливаться в аппараз Гольджи, так как они не могут в таких условиях связыватьс с лизосомными ферментами.
Поскольку все молекулы гликопротеинов, которые попадают в а~ парат Гольджи, содержат одинаковые )ч-связанные олигосахари ды, то сигнал для присоединения единиц М6Ф к олигосахаридв должен быть на каком-то участке полипептидной цепи кажка гидролазы, Сигнал узнавания на лизосомных гидролазах представляет собо1 по-видимому, сигнальный участок специфической конформацв а нс сигналъный пептид, судн по тому, что узнавание фактичеся прекращается при частичной денатурации гидролазы.
При 1-клеточной болезни лизосомы в клетках некоторых типа содержат нормальный набор лизосомных ферментов, что указыв ет на существование второго пути сортировки гидролаз в лии сомы, который действует лишь в некоторых, но не во всех клетки Внутриклеточная сортировка макромолекул 123 ли- Самое удивительное то, что и среда от культуры клеток Херлера исправляла дефекты в клетках Гюнтера (и наоборот). Присутствующие в среде корректирующие факторы инактивировались протеазами, а также прн обработке периодатом, разрушающим углеводы, илн щелочной фосфатазой, отщепляющей фосфатную группу от сложных молекул. А.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
