Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 41
Текст из файла (страница 41)
Дисп содержат, по-видимому, большее количество ДНК, чем мсждискь вые участки. Возникает ли эта разница в связи с тем, что в диски ДНК реплицируется более интенсивно, чем в междисковых учасу. ках, или же вся ДНК реплицнруется одинаково, но уложена ои ~аким образом, что диски содержат больше ДНК, чем мек дисковые участки? Вы можете найти ответ на этот вопрос, поскольку получил последовательный ряд клонов, который охватывает отрезок дли ной 315 т.п. н. ДНК дрозофилы, включающий примерно 12 дискс1 и междисковых участков. В качестве зондов для гибридизации вя можете использовать радиоактивно меченные фрагменты этн клонов, чтобы определить количество комплементарной нм ДНК присутствующей в диплоидных тканях и полигонных хромосома, Вы выделяете ДНК из диплоидных тканей и политенных хромо сом, обрабатываете равные количества ДНК рестриктазами, взя,' тыми в различных сочетаниях, разделяете фрагменты путем гела," электрофореза и переносите их на нитроцеллюлозные фильтры дяь гибридизации.
В каждом случае набор фрагментов, образовавши) .1 ся при рестрикции, одинаков для ДНК из диплоидных тканй1 и политенных хромосом, как показано на рис. 9-12. Вы измеряеуф интенсивность полос многих специфических фрагментов, образо, вавшихся при рестрикции, и выражаете результат как отношеня? интенсивности полос фрагментов из политенных хромосом к вй1 тенсивности полос соответствующих им фрагментов из диплош) ных тканей (рис. 9-13). Подтверждают ли ваши результаты предположение о том, чп1 в основе различия между дисками и междисковыми участкам~ лежит дифференциальная репликация, или же данные говорж~ в пользу различий в упаковке? Нлпревпение папимериввиии Рве. 9-13.
ДНК в ра: из двплои~ ных хромс мент хром клоннрова фрагмента нем указау и диски. К ты нзобра отмечено 1 тов 2851 фрагмента уровней ег политевнь двплоиднь РНК.папи Осе хромосомы типа ламповых щеуаи Рае. 9-11. Схематическое изобра- жение хроматиновой петли, пред- ставляющей собой одну транс- крипцнонцую единицу (задача 9-! 3) Продвижение молекул РНК-поли- меразы вдоль петли отражено в уллинеиии новосинтезироваиных цепей РНК, связанных с каждой полимеразой. Клеточное ядро 139 2842 2148 а о я и аи1 2148 г о а и 9 !5 Для выяснения взаимосвязи между структурой хроматина и экспрессией гена вы изучаете два типа клеток цыпленка. Эритроциты цыпленка экспрессируют большие количества глобиновой мРНК, а в фибробластах глобин вообще не синтезируется.
Вы хотите выяснить, в одинаковых или в разных хроматиновых структурах находятся последовательности ДНК, кодируюшие глобин в этих двух типах клеток. Для изучения структуры хрома- тина вы используете две нуклеазы: микрококковую нуклеазу и панкреатическую дезоксирибонуклеазу 1 (ДНКаза 1). Вы готовите меченную 'Н-тимиднном ДНК (кДНК), комплементарную глобиновым мРНК из эритроцитов. Эта глобиновая кДНК полностью расщепляется нуклеазой, узнающей одноцепочечные участки ДНК (нуклеаза 51). Однако если вначале провести гибридизацию кДНК с избытком ДНК цыпленка, то более 90% препарата окажется устойчиво к последующей обработке нуклеазой В1.
Вы изучаете действие микрококковой нуклсазы и ДНКазы 1 на способность ДНК из эритроцитов и фибробластов предохранять кДНК. Чтобы сохранить природную организацию хроматина, вы обрабатываете нуклеазой выделенные ядра до того, как экстрагируете ДНК и проводите гибридизацию. При обработке ядер из эритроцнтов или фибробластов микрококковой нуклеазой (до такого состояния, когда разрушается около 50% ДНК) получаются препараты ДНК, еще способные защитить от последующего расщепления нуклеазой э1 более 90% кДНК. Аналогичным образом при обработке ядер фибробластов ДНКазой 1 (до такого состояния, когда разрушается менее 20% ДНК) полученные препараты ДНК предохраняют более 90% кДНК. Однако при такой же обработке ядер эритроцитов ДНКазой 1 получаются препараты ДНК, способные предохранить лишь около 25% кДНК. Эти результаты суммированы в табл.
9-1. Вы повторяете некоторые из этих измерений, используя вместо глобиновой кДНК суммарную ДНК из эритроцитов, меченную 'Н-тимидином. Гибридизация с общей ДНК или с ДНК, обработанной микрококковой нуклеазой, обеспечивает защищенность более 90% ДНК, меченной Н-тимидином, а гибридизация с ДНК, обработанной ДНКазой 1,— всего лишь 78%а Н-ДНК (табл. 9-1).
В последней серии экспериментов вы сначала получаете препарат нуклеосом, обрабатывая хроматин микрококковой нуклеазой. ДНК нуклеосом предохраняет более 90% глобиновой кДНК. После обработки нуклеосом ДНКазой 1 получается ДНК, предохраняющая всего лишь 25% глобиновой кДНК. Далее вы подвергаете нуклеосомы кратковременному воздействию трипсина, чтобы удалить 20 — 30 аминокислот с )х)-конца каждой молекулы гистонов, дополнительно расщепляете модифицированные нуклеосомы микрококкоеой нуклеазой и выделяете ДНК. Такая ДНК но и- ся йк.
9.12. Радиоавтограф, получен- ный при анализе методом блот- пебрадизации ДНК из политенных граиосом (Р) и диплоидных тканей 03) (задача 9-14). Числа наверху або!качают клонированнь!е фраг- югпы ДНК, использованные в жчсстве зондов; 2851 и 2842 †фраг- исаты изучаемой области, имею- щей двину 315 т. п. н. (см.
рис. 9-! 3); (регыснт 2148- из другой области ивана, он использован длл калиб- Равка количества ДНК, нанесен- ного на гель. .в- оак .в- 1С- ль !Пы но их ки оах тна ж- ион !ы их К, х. .я- ьтя хсй ге оие н- д- Ркс. 9-13. Соотно!псине количеств ДНК в разных участках хромосом ез двллоидных тканей и политенпнх хромосом (задача 9-14). Сегнсат хромосомы, похрываемый мапированными рестрикционными (рзгмснтами, изображен внизу, на жи указаны хромосомные области и лиски. Клонированные фрагмен!и изображены над хромосомой, етисчено расположение фрагментов 2851 и 2842. Над кажлым брагысатом указано атно!ление лювнсй его гибридизации с ДНК из вапитснных хромосом и с ДНК из ипшоилных тканей. Понесенные/диппеидне!е е,а --"---а---ж-4-е- — -;- — ---- ° -аж-- — — ---и-' — -,--з.-- а т.п.н.
а ка лю гаа ма ма заа го ги вт з 4 а,а Неыео поносы В !1!2 !4 1,2 азпв Вг Е 140 Глава 9 Таблица 9-1. Защита кДНК глобииа и суммарной ДНК из эритроцитав препарз, тами хроматииа, обработанными и пе обработанными иуклеазой !залача 9-15!;. Обработка иуклеазой Защишеииаа Защищеииаа, кДНК ДНК из эритрь"„ глобаиа цитов, % Избыток ДНК 93 92 Общая ДНК ДНК из эритроцитов 25 91 ДНК из эритроцитов ДНК из фибробластов ДНК из фибробластов Нуклеосомы Нуклеосомы Нуклеосомы, обрабо- таиные трипсииом 91 91 25 25 предохраняет 83% суммарной ДНК эритроцитов, но всего линз 25% глобиновой кДНК !табл. 9-1). А. Какая из нуклеаз-микрококковая или ДНКаза 1 — расщепляе экспрессирующийся хроматин !активный хроматин)? Как можа! зто определить? Б. Какая фракция ДНК эритроцитов входит в состав активно! хроматина? В.
На случайную или на специфическую, чувствительную к микро кокковой нуклеазе, популяцию нуклеосом действует трипсин? К это онределить? Г. Определяется ли отличие активного хроматнна от всего ост ного хроматина свойствами отдельных нуклеосом или же оа связано с тем, как упакованы нуклеосомные частицы в структур ' более высокого порядка в клеточном ядре? 9-1б Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. Фаза клеточного цикла„в ходе которой происходит синтез ДН называется Б.
ДНК инициируется на определенной последовате, ности ДНК, которая называется В. Точки начала репликации обычно активируются в составе кла сп 0 , ~ 00-00 * г. и *, 00е ° 0 ся с сайтом (точкой) начала репликации БЧ40 и действуют одя временно как белок, участвующий в инициации, и как ДНК-! ои, каза, чтобы открыть спираль ДНК в этом сайте. Д. Поскольку весь геном должен быть реплицирован только одя кратно, точки начала реплнкацни в эукариотической кле должны инактивироваться по мере их использования; ДНК удаляется во время или перед началом мито 9-17 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а кие †н.
Если утверждение неверно, обьясните почему. А. Репликативная вилка у бактерий и зукариот передвигается Без обработки Микрококковая иуклеаза ДНКаза 1 Микрококковаа пуклеаза ДНКаза 1 Без обработки ДНКаза 1 Микрококковая иуклеаза Репликация хромосом !МБК 9З) 95 94 94 80 83 Клеточное ядро 141 ж гро. В. Г. 3. го тьно ры 9-18 Вы изучаете синтез ДНК в линии культивируемых клеток, используя стандартную методику. Согласно этой методике, к клеткам добавляют зН-тимидин, который включается в репликативные вилки. Затем клетки осторожно лизируют в днализном мешочке, чтобы из них вышла ДНК. При прокалывании мешочка и медленном выпускании из него раствора некоторые цепи ДНК прилипают к стенкам и растягиваются в направлении тока жидкости. Этот метод позволяет выделить в интактном виде очень длинные цепи ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
