Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 45
Текст из файла (страница 45)
Потерпев неудачу с дЩ гимн методами, вы решаете испробовать этот подход. Для калибровки сисгемы вы определяете транскрипцию ген рибосомной РНК. Траискрипцнонная единица 53-рРНК содер Рис. 9-23. С пиоииой ед (А) и чувст фиолету тр 59-РНК и т (Б) (задача положение дов относи (левый коп циоииой ед в зависимо ультрафио> дог-гибрид ставленная Клеточное ядро 161 Рдз.9-23. Строение трапскряп- яяояяой единицы рябосомяой РНК (д) я чувствительность к ультра- 95атету трааскряпцяояпых единиц й-РНК я других рябосомиых РНК (Ь) (задача 9-28). з(, Указано рас- пслокепяе гябрядязацнояяых зоя- дов отяосятевьяо промотора (нзцй конец стрелки) в транскряп- яиояяой единице. Б.
Транскрипция ззаяясямости от дозы облучения уды(вфяолетом, выявленная пря взт-гибридизации (слева) я пред- спвяеяяая в виде графика (справа). Д. ТРАНСКРИПЦИОННАЯ КАРТА 185 585 гВ5 дзз — н 1 з.п.н. зонды 5, Р5АКЦИЯ НА ДОЗУ УФ-О5ПУЧ5НИЯ а й 1 00 з о з а И ю 8 $ зз О Доза УФ 55-РНК ф ф ф ф ф РРНК! ф ф ф ф ф РРНК2 фф фф ф ррнкз ффффф РРНК4 ф ф ф ОСО эав.
вяв е 56 ЧТО гно 10 200 400 800 800 Дазз УФ, зримм д!и !етт Нит ВЫ 1НС. немногим более 100 нуклеотидов, тогда как гены 183-, 5,83- и 283-рРНК составляют часть одной транскрипционной единицы длиной 8 т.п.н. (рис. 9-23,А). Вы облучаете трнпаносом ультрафиолетом в возрастающих дозах, выделяете ядра и инкубируете их с згР-з(ХТР. Затем выделяете из ядер РНК и гибридизуете ее с клонированной ДНК, кодирующей ген 53-РНК и различные фрагменты транскрипционной единицы рибосомной РНК (рис. 9-23,Б).
Если на графике откладывать логарифм значения радиоактивности в зависимости от дозы ультрафиолетового облучения, то получится прямая линия (рис. 9-23,Б). Угол наклона такой линии пропорционален расстоянию от промотора до области гибридизации зонда. Если вы повторите этот эксперимент с зондом, комплементарным началу гена Ч3О, то обнаружите, что транскрипция инактивируется примерно в 7 раз быстрее, чем в случае зонда 4 транскрипционной единицы рибосомной РНК. А. Почему чувствительность транскрипции РНК к ультрафиолетовому облучению увеличивается по мере увеличения расстояния от промотора? Б.
Сделайте приблизительную оценку того, на каком расстоянии находится ген Ч3О от своего промотора. Какое допущение следует сделать, чтобы определить зто расстояние? В. Вы обнаружили другой ген, расположенный перед геном Ч3О на расстоянии примерно 10 т.п.н. Транскрипция этого гена приблизительно на 20% менее чувствительна к ииактивации ультрафиолетом, чем транскрипция гена Ч3О, Могут ли этн гены транскрибироваться с одного промотора? КЕ5 !ат. уст рм ь; Ъ(8 .от. зм Ю * ой ть' ть зй 9-29 Вы изучаете ДНК-содержащий вирус, который на поздних стадиях инфекции синтезирует ряд белков в больших количествах. мРНК для одного из этих белков соответствует рестрикту из середины линейного генома. Чтобы точно определить локализацию этого фрагмента, вы гибридизуете мРНК с очищенными рестриктами в условиях, когда стабильными оказываются только дуплексы ДНК вЂ” РНК, а цепи ДНК не спариваются.
При изучении дуплексов, 152 Глава 9 Рнс. 9-24. Гибрид ДНК вЂ” РНК ме- жду мРНК н рестрвкцнонным фрегментом адсновнрусе (задача 9-29). Ф ее ,Ф оь л Ф яр г н оо 9 ~~ Ф,99 ,(Р 4' е Э' л с с е е л л с л л л л л е л ° л»ю с с Рве, 9-2В нуклеот» нвмдшес нувлеот» (задача ' носта н» способ щ нредшос туру, по Участок ' клльной участок в(В). В, обозная» 2 Э 4 с е л е л е е л с с л л е о е е е л е е е с е е е л е с образовавшихся в ходе гибридизации, вы видите с помощью'.
электронного микроскопа структуры, подобные представленной я»,' рис. 9-24. Почему на концах гибридов ДНК вЂ” РНК наблюда»отс»( одноцепочечные «хвосты»? 9-30 3'-Концы эукариотических мРНК в большинстве случаев определь ' ют путем расщепления РНК-предшественника и последующег» присоединения ро1у(А)-хвоста длиной от 200 до 300 нуклеотидоа. Главным сигналом для полиаденнлнрования служит последов» тельность АА13ААА, расположенная непосредственно на 5'-конев сайта полиаденилирования. Значение этого сигнала определял разными способами.
Один элегантный подход заключался в ве пользовании химической модификации, которая препятствует спе цнфическому взаимодействию с белком. Этот метод состоит» том, что РНК, содержащую сигнальную последовательносп„ обрабатывают диэтилпирокарбонатом, который взаимодействую с А и О с образованием карбоксиэтилированных производных Такая обработка делает модифицированные сайты крайне чувст. внтельньпми к разрушению анилином в соответствующих условию. Если исходные молекулы РНК пометить с одного конца и обри. ботать так, чтобы в среднем на одну молекулу РНК приходилао одна модификации, то при расщеплении анилином образуста серия фрагментов, длина которых будет соответствовать расла ' ложению А и О в РНК (рис.
9-25, дорожха 1). (Этот мета" полностью аналогичен методу определения последовательносп' нуклеотидов ДНК.) Для определения искомых остатков А и О модифицированные но еще целые молекулы РНК инкубируют с экстрактом, обеспечв вающим расщепление и полиаденилирование. Молекулы РН1 затем разделяют на ро!у(А)'- и ро1у(А) -РНК, обрабатывавя' анилнном и фрагменты анализируют в геле (дорожки 2 и 3). ))» второй пробе к экстракту добавляют ЭДТА, что препятствую полиаденилированию, но не влияет на расщепление.
Расщеплении» молекулы затем выделяют, обрабатывают анилнном и тавж наносят на гель (дорожка 4). Рнс. 9-25. Радноавтографнческое определение пурннов, важных для расщепления н полнеденнлнровання (задача 9-30). Последовательность РНК-предщественннка указана слева, причем 5'-конеп расположен внизу, а 3'-конеп — ввер- ху. Все молекулы РНК были моднфнпнрованы в реакции с днзтнлпнрокарбонатом.
Дорожка! — РНК, не обработан- ная экстрактом (Необработанная). Дорожка 2 — РНК, обработанная экстрактом, но не полнаденнлнрованная гро1у(А) ). Дорожка 3 — полнеденнлнрованная РНК (ро1у(А)+). Дорожка 4 — расщепленная, но не полнаденнлн- рованная РНК (Расщепленная). Клеточное ядро 163 А. Какие концы исходных молекул РНК были помечены? Б. Объясните, почему полосы, соответствующие сигналу АА()ААА (отмечены на рис. 9-25 квадратной скобкой), отсутствуют в случае ро!у(А)'-РНК и расщепленной РНК? В.
Объясните, почему полоса, помеченная стрелкой (нуклеотид, к которому в норме добавляется ро1у(А)'3, отсутствует в случае ро!у(А)ч-РНК и присутствует в случае расщепленной РНК. Г. Какие нуклеотиды А и О важны для расщепления и какие для полиаденилирования? Д. Какую информацию можно получить, наметив молекулы РНК с другого конца? ю ~а :я го ь е и 4. Гистоиоаая РНК.ярвлшяствеииик Человек 5' з' Ассслллаасосощшслаласслссслс оолооссллсалллаоласоаоаломоо Ъ. )Ь26. Последовательность 4ниотыдов гистоповых РНК- 5)чдпкствеиииков (А), олигоиды ДНК (Б) и мяРНК (В) ча 9.31).
А. Последовательпяяертироваппых повторов, Икпбяьп образовать в молекуле естяеипика шпилечпуш струк- Б подчеркнуты стрелками. к расщепления указан вертиой стрелкой. Консервативный ок подчеркнут линией на (А) (5).В. щ,б — триметил-кзп, харакддя ()-РНК. Буквой 1Ч штеп неизвестный иуклеотид. Морской яж 5' з лмсаасосщялгслаласслсс Аслсссссллалллалоососаооллл Н. Ояигоиукяеотилы ДНК Человек 5 АСПЛлддтлаетата З Мышь 5 ' саялллаластатт 3 ' Обобщенная 5 ' Аллйкааалаетаат 3 ' последовательность В. 07-мяРНК человека 5' яэа-апапапплелаСОСООООЛалИЛааОСОЛап.. З 9-31 В отличие от большинства информационных РНК гнстоновые мРНК не содержат ро!у(А) на своих 3'-концах.
Вместо этого они содержат другие дополнительные нуклеотиды за счет того, что отщепляются от своего длинного предшественника на несколько нуклеотидов ближе к 3'-концу шпилечной структуры. Кроме того, правильный процессинг предшественника гистоновой мРНК зависит от консервативной последовательности, расположенной непосредственно за участком расщепления. Судя по данным, полученным на морских ежах, эта консервативная последовательность взаимодействует с РНК, входящей в состав ()?-мяРНП. Вы изучаете процессинг гистоновых мРНК в клетках млекопитающих и хотите узнать, зависит ли формирование их 3'-конца от тех же взаимодействий. Как показано на рис.
9-26,А, между 3'-концами гистоновых мРНК морского ежа и человека наблюдается поразительное сходство. Вы показали, что ядерные экстракты клеток человека «правильно» расщепляют меченый синтетический предшественник гистоновой мРНК. Более того, если экстракт предварительно обработан нуклеазой для разрушения в нем РНК, он теряет способность расщеплять добавленный после этого предшественник гистоновой мРНК. Можно восстановить активность обработанного экстракта, добавив к нему частично очищенную фракцию, содержащую мяРНП. Для более детального изучения процессинга вы синтезируете олигонуклеотиды ДНК, соответствующие области вокруг предполагаемого участка взаимодействия гистонового предшественника с мяРНП.
Один олигонуклеотид содержит консервативную последователъность человека, другой олигонуклеотид-эту же последо- 164 Глава 9 вательность мыши и третий †обобщенн последовательносу полученную на основе сравнения всех известных подобных конел вативных последовательностей у млекопитающих (рис. 9-26,) Когда вы предынкубируете эти олигонуклеотиды с экстракте в присутствии РНКазы Н (она разрезает РНК в гибрцв ДНК вЂ” РНК), то процессинг предшественника полностью блок руется консервативными последовательностями мыши и обобша иой последовательностью, тогда как олигонуклеотилы, насую консервативную последовательность человека, не оказывают ниг кого влияния. Два олигонуклеотида, проявляющие ингибируюп действие, также вызывали исчезновение из экстракта молев мяРНК, состоящих из 63 нуклеотидов.
Вам удалось выдела эту мяРНК и определить последовательность на ее 5'-кои (рис. 9-26, В). А. Объясните смысл эксперимента с олигонуклеотидамн. Что ( пытались узнать, инкубируя экстракт с олигоиуклеотидами Дй в присутствии РНКазы Н? Б. В опыте был использован экстракт из клеток человека, поэтому я удивило, что олигонуклеотид, содержащий консервативную пост довательность человека, не подавлял процессинг, а олигонуклеоч ды, содержащие консервативную последовательность мыши": обобщенную последовательность, ингнбировали его.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
