Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 48
Текст из файла (страница 48)
(Обработка 5-аза-С снижает общий уровень 162 Глава 10 метилирования ДНК, что способствует активации ранее неактив.~ ных генов.) Если после обработки клетки растут в условиях низкойс плотности культуры, то они вначале сохраняют свои исходныз свойства фибробласгов, но все же дифференцируются позже, когдз) проходит много поколений и культура достигает высокой плот. ности. Клетки 10Т1~2, не обработанные 5-аза-С, не дифферендя.
руются, какой бы ни была плотносп культуры. При днфференцнровке обработанных клеток около 25% из щц превращаются в мышечные клетки (миобласты). Высокая частоп образования миобластов наталкивает вашего руководителя ж мысль, что всю трансформацию может запускать единственнвй главный ген-регулятор, который в норме находится в репресск. рованном состоянии вследствие метилирования. Чтобы это ирою ' рить, руководитель уговаривает вас провести дорогостоящую поисковую работу; проклонировать этот ген1 Вы предполагаете что ген до обработки 5-аза-С находится в выключенном состояип и включается лишь в индуцированных миобластах.
Если зп предположение правильно, то среди кДНК-копнй с мРНК, сини зируемых после обработки 5-аза-С, должны обнаружиться посла довательности, соответствующие этому гену. Вам необходимо проверить имеющуюся библиотеку кДНК нормальных миобластов (которые в соответствии с вашим предло ложеннем также будут экспрессировать этот ген), используя на радиоактивных зондов для идентификации искомых клонов кДНКК Вы готовите три радиоактивных зонда.
Зонд 1. Вы выделяете РНК из миобластов, индуцирова 5-аза-С, и готовите радиоактивные кДНК-копии. Зонд 2. Вы гибридизуете радиоактивную кДНК для индуцировм ' ньзх миобластов с РНК из необработанных клеток 10Т11 н удаляете все гибриды ДНК вЂ” РНК.
Зонд 3. Вы выделяете РНК из нормальных миобластов и готов радиоактивно меченые кДНК-копии„которые затем г ридизуете с РНК из необработанных клеток 10Т1~2, и чего удаляете гибриды РНК-ДНК. Первый зонд гибридизуется со многими клонами из библио ки кДНК, но лишь около 1в/в из этих клонов гибридизу с зондами 2 и 3. Всего вы обнаруживаете четыре различных гибридизации (табл. 10-2). Таблица 10-2. Гибридизация кДНК-коций РНК миобластов с рациоактв меченными зондами (задача 10-5) Класс Зонд 1 Зонд 3 Зоил 3 А В С 13 А. Для чего проводилась гибридизация меченой кДНК для типов миобластов с РНК из необработанных клеток 10Т!, Иными словами, зачем нужны зоцды 2 и 3? Б. Какие общие гены вы ожидаете обнаружить в каждом из четы классов кДНК-клонов (А, В, С и Р в табл. 10-2)? Какой к кДНК-клонов вероятнее всего содержит последовательн соответствующие искомому гипотетическому гену — регулятору! и Контроль генной экспрессии 163 Контроль инициации транскрипции 1МБК 10.2) зй яе ца т- н- вается с Б.
Белок- подавляет транскрипцию 1ас-оперона, связы ваясь с определенной последовательностью ДНК, называемой оператором, которая перекрывается с промотором. га яй и|сю яи го В. При связывании белка- с определенной последовательностью ДНК ген выключается. Такой тнп регуляции называется Г. Прн контроле белок— связывается с опре- деленной последовательностью ДНК, что способствует транскрип- ции близлежащего гена.
Д. Белок— дает возможность клеткам Е, сой использо- вать альтернативные источники углерода в том случае, когда отсутствует его предпочтительный источник †глюко. Е. — это одна нз пяти основных полипептидных цепей РНК-полимеразы, которая функционирует прн инициации и отде- ляется от ДНК, как только полимераза начинает синтез РНК. Ж. , связывающнйся с обобщенной последовательностью эр К. ТАТААА, обычно остается в стабильном , который может участвоватьмногократно в циклах транскрипции,осуществляемой молекулами РНК-полимеразы П. 3.
Необходимый для транскрипции генов участок ДНК длиной примерно 100 нуклеотидных пар, расположенный перед сайтом инициации синтеза РНК, называется И. активен как в прямой, так и в обратной ориентации; его активность проявляется даже при удалении на расстояние более чем 1000 п.н. от промотора, и он способен активировать транскрипцию, находясь как перед геном, так и позади него. 10-7 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие— нет. Если утверждение неверно, объясните почему. Аллолактоза, образуемая клеткой в присутствии лактозы, снимает репрессию с лактозного оперона, связываясь с оператором н сти- мулируя транскрипцию.
У бактерий белок-активатор связывается с определенными после- довательностями ДНК, которые расположены таким образом, что активатор может входить в контакт с РНК-полимеразой н тем самым повышать вероятность инициации транскрипции. В активации генов, связанных с метаболизмом азота, участвуют белок п1гС, который включает гены лишь тогда, когда находится в фосфорнлированной форме, а также фермент, белок шгВ, кото- рый может как фосфорнлировать, так и дефосфорилнровать белок птгС. В то время как в клетках эукариот регуляпия белками-активато- рами, которые воздействуют на транскрипцию из удаленных от гена регуляторных сайтов, является наиболее распространенным способом регуляции, у прокариот подобный тип контроля до сих пор не обнаружен.
Сигма-факторы связываются с РНК-полимеразой, но не взаимо- действуют со специфическими последовательностями ДНК. Белок- активатор связывается со специфическими последовательностями ДНК, но не взаимодействует с РНК-полимеразой. Бактериальная РНК-полимсраза узнает последовательность ДНК, а эукариотическая РНК-полимераза обычно узнает комплекс па не Г.
ех 10-6 Заполните пропуски в следующих утверждениях. А. Для того чтобы начать транскрипцию, РНК-полимераза связы- 164 Глава 10 И К 10-8 Клетки Е. сой растут на моносахариде глюкозе быстрее, чем дисахариде лактозе, по двум причинам: 1) лактоза поглощ медленнес, чем глюкоза, и 2) для того чтобы лактоза использоы ' лась клетками, она должна быть сначала гидролнзована б-гала( тозидазой до глюкозы и галактозы. Если Е. сай выращивать на среде, содержащей одновремеан глюкозу и лакгозу, то кривая роста будет иметь сложную фор (рис. 10-3, квадратики). Вначале бактерия растет с большей ростью, чем в конце периода роста, а между этими двумя фаза роста наблюдается период задержки, когда рост практиче останавливается. Опредсление концентрации глюкозы и лахте( в среде показывает, что после нескольких циклов деления клет ' содержание глюкозы резко снижается (рис.
10-3, кружки), а ко, центрация лактозы остается высокой почти до конца. Хотя к центрацня лактозы остается высокой в течение всего эксперимея однако ген б-галактозидазы, регулируемый как часть 1ас-опере индуцируется только через 100 мин (рис. 10-3, треугольники). А. Объясните, почему кривая роста бактерий в этом эксперимен имеет такую форму. Учтите быстрый начальный рост, замедле роста в конце и остановку роста в середине опыта.
я Ф к й Р 10 Рис. 10-3. Рост Е. сай на среде с глюкозой в лактозой (задача 10-8). 0 200 100 0 100 Время, ияя ДНК-белок, образованный основными факторами транскрипции Методы рекомбинаитных ДНК в совокупности с анализом 1п р( дают возможность идентифицировать регуляторные области эук риотических генов, даже если неизвестно, какие белки-регулято с ними связываются. Обычно энхансеры высокоактивны во всех типах клеток, но луч всего они работают в клетках, экспрессирующих ген, с которы энхансеры в норме ассоциированы.
Если у белка — рецептора глюкокортикоида ДНК-связываю домен заменить на ДНК-связывающий домен белка — рецепте эстрогена, то гибридный белок-регулятор будет активирова в ответ на глюкокортикоид гены, зависимые от эстрогена. У эукариот белки-регуляторы почти всегда активнруются В инактивируются в результате связывания с небольшими сиги ными молекулами. Если в белке-регуляторе домен, активируюшнй транскрипцию заменить на участок, всего лишь обогащенный кислыми амины кислотами, то можно получить заметную активацию генов к у дрожжей, так и у млекопитающих.
10 ЯЯ х$ ко 8 Ря 03 м ж ек Рвс. 1( ВВЯ РС 'шмп , глутак Норм; регуля Востяе ПРОМ0 сайгы Вы. Е : связы~ ДВаиу Контроль генной экспрессии 1бб Б. Объясните, почему 1ас-оперон не индуцируется лактозой во время короткой начальной фазы роста бактерий.
,ии. г1го ка- гры ше ым гнй тра лть ли ль- ю, то- сак на гся ва- зк- но му юзы ок >н- ига, та, Сайты связывания Ген птгС гпугаыинсинтегаз ;те ие Сайг связывания РНК-пспимаразы Ган глутаминсинтетазы Сайты связь~ванин ппс делетирсваны Сайт связывании РНК.пслимеразы Ряс!04. Трн матрицы для нзучс- ьн роли слйтов связывания с бел- тси л1гС в транскрипции гена пугаиннсннтстазы гзвдачв 10-9). А. Нормальный ген с ннтвктнымн уагулягорнымн послсдоввтель- нсимн, расположсннымн перед тусиотором. Б. Ген, в котором сйтн связывания п1ГС делетнрова- ьь В.
Ген, в котором сдйты иинзвння с белком пггС вере- пявуты л 3 скопцу. Свиты связывания лпс леРаменыиы на другую стсрсну ст гена Ген глутаминсинтегезы Сайт связывании РНК-пспимеразы 10-9 Транскрипция бактериального гена, коднрующего фермент глутамннсинтетазу, регулируется в соответствии с доступностью клеточного азота. Ключевым регулятором транскрипции в этом случае является белок п1гС, который стимулирует транскрипцию только после того, как будет фосфорилнрован. Фосфорилирование белка п1гС контролируется белком п1ГВ, который одновременно является протеннкиназой и протеинфосфатазой. Равновесие между кнназной и фосфатазной активностями, а следовательно, фосфорилирование белка п1гС и транскрипция глутаминсннтетазы определяется другими белками, которые зависят от соотношения а-кетоглутарата и глутамнна.
(Это соотношение является чувствительным индикатором доступности азота, поскольку для образования глутамнна к а-кетоглутарату должны присоединиться два атома азота в виде аммония.) Транскрипцию гена глутаминсннтетазы можно получить ш уггго, если к линейной ДНК-матрице, содержащей ген и соответствующие регуляторные элементы, расположенные перед промотором, добавить РНК-полимеразу, специальный сигма-фактор и фосфорилированный белок шгС, Анализ ДНК методом футпринтннга показывает, что белок п1ГС связывается с пятью сайтами, расположенными перед промотором. Хотя связывание белка пггС лишь незначительно увеличивается прн фосфорилнрованнн, транскрипция тем не менее полностью зависит от фосфорилнровання.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
