Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 51
Текст из файла (страница 51)
Конститутивный гетерохроматин присутствует в необычно конденсированном ви- де лишь в некоторых типах интерфазных клеток. Поскольку у самок при образовании клеток зародышевой линии конденсированная Х-хромосома вновь активируется, в ее ДНК не может происходить стабильных изменений. Наследование способа инактивации хромосом в форме гетеро- хроматина, например инактивации Х-хромосомы, вполне можно объяснить механизмами генетического контроля, целиком зави- сящими от действия диффундируюших белков-регуляторов. Экспрессия трансгенов часто ограничена теми тканями, в кото- рых данные гены экспрессируются в норме; тем не менее уровень транскрипции обычно в пять — десять раз ниже, чем тот, что наблюдается в ткани, где ген экспрессируется на высоком уровне. Фенотипические проявления некоторых мутапий заставляют предположить, что активация генов у высших эукариот происхо- дит в две стадии: на первой стадии открывается болыпой домен хромосомы, на второй стадии активируются элементы, специфи- чески регулирующие ген, При расплетании ДНК в одном определенном сайте могут возникать топологические эффекты, которые оказывают влияние на всю хромосому.
Поддерживающая метилаза обеспечивает сохранение ранее су- ществовавшего типа метилирования СО-последовательностей, а устанавливающая метилаза проводит изначальную разметку 172 Глава 10 сайтов, метилируя СО-последовательности в яйцеклетках. Если клетки в течение короткого периода времени инкубировиз в присутствии 5-аза-С, то это основание включается в ДНК, г действует как ингибитор поддерживающей метилазы, спики таким образом общий уровень метилирования и активируя ран не экспрессировавшиеся гены. СО-островки в промоторных областях генов «домашнего хозя» ства» сохранились в ходе эволюции благодаря тому, что сз ис специфические белки, связывающиеся с ДНК, защищают 5-,чс тилцитозин в этих островках от случайного дезаминирова и превращения в Т-нуклеотиды.
Н О 10-16 Рис. 1 вых б содер: галло вые п 10-17) иых с смесь специ пении иых г ции г пратс из эт Посл с Рев иыяы ДНК А Рис. 10-9. Результат гибридизации фрагмента» ДНК из клесок Е. сей, способных к переключению 1задача 10-16). Стрелками указаны одноцепочечные глазки. Среди патогенных организмов довольно распространена спос пб ность периодически изменять свои поверхностные структури с целью загдиты от иммунного ответа хозяев. Так, бактерии роя йайлапейи (способные вызывать пищевые отравления) ма ср существовать в двух формах, различающихся своими антигении мн детерминантами, или фазами, как они были названы первооз крывателями в 1922 г, Бактерии, находящиеся в двух раз им' фазах, синтезируют разные типы флагеллина- белка, образуюшс го жгутик. Бактсрии, находящиеся в фазе 1, переключаются и фазу 2 примерно один раз на тысячу делений клетки. С такой ж частотой происходит и обратный процесс.
Изначально бы выдвинуты две гипотезы о механизме переключения: перестро иг ДНК, например вставка или инверсии, и модификация ДНК например метилирование. Два типа флагеллинов, ответственных за фазовую вариации кодируются несцепленными генами Н? и Н2, каждый из которы кодирует полностью функциональный флагеллин. Генетичес ки1 элемент, ответственный за переключение фаз у бактерий, раппа ложен очень близко к гену Н2. С целью выявить механик ответственный за переключсние, был проклонирован фрагмек ДНК, содержащий ген Н2.
При введении этого гена в Е, сой, и имеющую жгутиков, большинство клеток, включивших плаз ми ду, приобретали подвижность, т.е. синтезировали флагсллиг кодируемый геном Н2. Однако в немногих колониях Е. с клетки были неподвижными несмотря на то, что несли плазмщи Если из клонов таких неподвижных клеток выделяли ДН1 и вводили ее в свежие культуры Е. сой, то некоторые и трансформированных бактерий приобретали подвижность, тл в них начинается синтез флагеллина Н2.
Из культур, в которых произошло переключение, выдела ДНК, обрабатывали ее рестриктазой, нагревали, чтобы цеи ДНК разделились (плавлении), и затем медленно охлажд чтобы цепи ДНК опять соединились 1гибрндизация). Затем моли купы ДНК изучали с помощью электронной микроскопии. При мерно 5% молекул содержали глазок, образованный диуы равными по длине сегментами одноцепочечной ДНК; глаза находился в одном и том же месте вблизи одного из концов. Ди такис молекулы показаны на рис. 10-9. Когда клетки Яайпопейа переключаются с синтеза флагеллии одного типа на синтез флагеллина другого типа, все клети сохраняют подвижность. Почему у Е. сой переключенис привода к замене подвижной формы на неподвижную? Объясните, как с помощью этих результатов можно определитг какой механизм ответственен за переключение:перестройка ДН1 или модификация ДНК? Контроль генной экспрессии 173 Попробуйте с помощью этих результатов определить, с каким типом перестройки ДНК связано переключение: с делецией, вставкой или инверсией ДНК? гь це эя ее 10-17 ф г- я ! ! 10-10.
Связывание регуляторбехков с фрагментами ДНК, кнлими а-специфические или яд-слецифические регуляториклсдоватсльности (задача 0). Регул»торные белки в разсочетаниях ннкубировали со пса.специфических и гаплоидфическпх радиоактивно мефрагментов ДНК (показаняадорожке 1). В концеинкубапробы ссажлали аитителами белков, и фрагменты ДНК вх осздков разделяли в геле. в этого гель экспонировали опекой пленкой, чтобы ть радиоактивные фрагменты + + + + + + »2— азу Намвчвиап в.спвцифичаска» ДНК— Нвмвчаив» гвппоид.спацифичавка» ДНК- + + + Ниакпа Высоков Гвппоид впацифичаска» ° .епацифиЧ»ока» -и 2 3 4 в 6 7 в Один из ключевых регуляторных белков, синтезируемых локусом, ответственным за тип спаривания у дрожжей, это белок-репрессор, обозначаемый а, 1см. МБК, рис.
10-29). В гаплоидных клетках, относящихся к а-типу спаривания, белок аэ выключает гены, специфические для типа спаривания а. В диплоидных клетках типа а?а репрессор а, действует совместно с продуктом гена а,, так чтобы в дополнение к а-специфнческим генам выключить набор гаплоид-специфических генов.
Двум наборам контролируемых генов в последовательности ДНК предшествуют, как было обнаружено, два разных, но родственных между собой типа консервативных последовательностей ДНК: одна из этих последовательностей расположена перед а-специфическнми генами, а другая — перед генами, специфическими для гаплоидиых клеток. Поскольку эти последовательности сходны, то репрессор аз скорее всего связывается с ними обеими, однако его свойства должны каким-то образом измениться под действием белка а, до того, как произойдет узнавание гаплоид-специфической последовательности. Вы хотите понять, за счет чего происходит это изменение.
Катализирует ли а, ковалентную модификацию а, или же а, модифицирует а, за счет стехиометрического взаимодействия с этим белком? Для ответа на этот вопрос вы ставите три варианта опыта. Во-первых, измеряете связывание а, и аз поодиночке и вместе, с двумя регуляторными сайтами ДНК, расположенными перед генами. Как показано на рис. 10-10, сам по себе белок а, не связывается с фрагментами ДНК, содержащими один из регуляторных сайгон (дорожка 2), тогда как а, связывается с а-специфическими фрагментами, но не с гаплоид-спецнфическими фрагментами (дорожка 3). В смеси а, и а, связываются как с а-спепифическими, так и с гаплоид-специфическими фрагментами 1дорожка 4).
Во втором варианте опыта вы вносите в реакционную смесь большой избыток немеченой ДНК, содержащей а-специфическую последовательность, а также смесь белков а, и аз. В этих условиях гаплоид-специфический фрагмент тоже связывается 1рис. 10-10, дорожка 5). Аналогичным образом, если вы вносите в реакционную смесь избыток немеченой гаплоид-специфической ДНК, а-специфический фрагмент все равно связывается 1дорожка 6).
Глава 10 В третьем варианте опыта вы варьируете соотношение а, н а, . Если а, присутствует в избытке, то связывание гаплонд-сп» цнфического фрагмента уменьшается (рис. 10-10, дорожка ?), если же в избытке а „то снижается связывание с а-специфическая ' фрагментом (дорожка 8). А. Находится ли а, в присутствии а, в двух формах, различаюшихп по специфичности связывания, нлн же в одной форме, которм может связываться с обеими регуляторными последовательное тями? Как с помощью ваших результатов сделать выбор ме~щ этими двумя возможностями? Б.
Репрессор аз, несущий небольшую делецию в своем ДНК-связы. вающем домене, не взаимодействует с фрагментами ДНК, содер. жашими гаплоид-специфическую последовательность. Если, оя пако, этот мутантный белок экспрессируется в диплоидной клети одновременно с нормальнымн белками аз и а,, то гаплоид-сп» цифические гены включены. (В норме эти гены в диплоидньа клетках выключены-см. МБК, рнс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
