Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 52
Текст из файла (страница 52)
10-29). Что представляети вам более вероятным в свете результатов, полученных в это» и других ваших экспериментах; а, катализирует ковалентн ую модификацию аз или же а, модифицирует аз в результая стехиометрического взаимодействия с этим белком и образом ' ния комплекса а,-а,? Р 10-11. разному мез 5$-РНК (А) ахтвввосгы явя л при р 10-19). Макс чен заштрях вмй ген — бе~ хамя. Буква метялнрова~ к расщеплен обозначена »оать — авакс 10-19 Вы хотите узнать, остается ли транскрипционный комля связанным с ДНК в ходе ее репликацни.
Если бы связь сох лась, она могла бы служить своеобразной биологической мятью, позволяюшей дочерним клеткам наследовать родит транскряпгс вмх на нор макси-гене .' стрелками ( 10-18 Вы обнаружили новый штамм дрожжей, отличающийся по си см, ме спаривания. У дрожжей существуют два типа спариваяи гаплоцдных клеток, получившие названия М и Р. Клетки про т» воположных типов спаривания могут сливаться с образованв»» диплоцдных клеток М/Е. В таких диплоидиых клетках могр происходить мейоз и споруляция, но они не могут спариват ьа друг с другом нли с гаплондными клетками одного из типо спаривания. Проведенный вами генетический анализ нового штамма пох зал, что у него имеются четыре гена, контролирующие тж спаривания.
Когда в локусе типа спаривания присутствуют ге»» М! н М2, клетки относятся к типу спаривания М. Если же в это покусе находятся гены Р! и Г2, то клетки относятся к тя»1 спаривания Е Кроме того, вы идентифицировали набор гено специфически экспрессируемых в гаплоидных клетках М-т (М»8), набор Р-специфических генов (Е»8) и набор генов, специ 9» ческих для споруляции (8»8).
Получив мутанты, дефектнъ|е и каждому из генов типа спаривания (все мутанты жизнеспособны) вы изучаете влияние этих генов на фенотнп спаривания н экспрессию различных наборов экспрессируемых ими специ 9» ческнх генов. Ваши данные для гаплондных и дипло клеток, относящихся к различным комбинациям мутантов, и ставлены в табл. 10-3. Предложите схему регуляции продуктами генов М1, М2, ! и Р2 экспрессии М-специфических, Е-специфических и специ ческих для споруляции наборов генов.
Укажите, какие из про д?» тов генов являются активаторами или репрессорами транскр цни н как действуют продукты этих генов — по отдельности и(я совместно. Контроль генной экспрессии 170 Таблица 10-3. Фенотнпы мутантов по типу спаривания у нового штамма дрожжей (задача 10-!8) Фенатпп снариваияи Эиспрессируемме гены Гаплоидные клетки Диплондные клетки Май †-специфические гены; Рай †.специфические гопы; Ззв †ге, специфические для слоруляции.
ский тип экспрессии генов. Вы как раз располагаете системой, с помощью которой можно было бы проверить это предположение. Вы можете собрать активный транскрипциоиный комплекс на гене 53-РНК из Хелп)зиз, встроенном в плазмиду, индуцировать его репликацию н затем проверить транскрипцию реплицировавшихся генов.
Все эти стадии вы можете проводить ш маго. Чтобы различить реплицировавшуюся и нереплицировавшуюся матрицы, вы используете преимущества рестриктаз (Ррп1, МЬо! и БапЗА), чувствительных к метилированию своего сайта узнавания СгАТС (рис.
10-11, А). Эта последовательность в нача- Оры МЬЫ В ЗА + — + г вв рнк м Макснгзн (мззнлнроаанный) Нормальный гзн (налалоенну мзтнлнроезнный) (нзматнлнроазнный) Б м + М Без обработка Орл! М)зз! Вязал Рзллнкзлнл Бзз Баз обра- обраватка Орл! МЬо! ВанЗА боткн Орл! МЬо! Валял Мк гм Гзн бз рнк йс. !0-11. Чувствительность ло- )мкому мепшированных генов УРРНК (А) и их транскриппионная 'нтязпссть в отсутствие реплика- мк в при репликацин (Б) (задача (Б)1). Макси-ген 58-РНК обозна- пк заштрихованными, а нормаль- , зий ген- белыми прямоугольни- и)н.
Буква М указывает, что цепь изтилирована. Чувствительность г Расщеплению рестриктазой 'збоишчена знаком (+), устойчи- ксш-знаком ( — ). Положение тршскриптов РНК, синтезирован- зих на нормальном гене и на иксячене 5Я-РНК, отмечено : пуелками (Б). Дикий тнп М М1 М2 М(, М2 Дикий тип Р Н Р2 Н, Р2 Дикий тип М, Р М! /Р! М! ('Р2 М2 ('Р! М2 /Р2 М Нет спаривания М Нет спаривания Р Р Нет спаривания Нет спаривания Нет спаривания Р Нет спаривания Нет спаривания М Мзй Мзй, Рзй Мзй Мяй, Рзй Рзй Рзк Рзк, Мзй Рзй, Мзй Бзй Рзй Мзй, Рзк, Бзй Нет Мза 176 Глава 10 ле гена 58-РНК встречается лишь один раз, и если разрезав ДНК по этому сайту, то транскрипция не происходит.
Есж выращивать матрицу в культуре Е. сой дикого типа, то последа вательность ОАТС будет метилирована по А в обеих цепи бактериальной йви-метилазой. При репликации полностью ме ти. лированной ДНК ш чйго в первом цикле образуются дочериидуплексы, у которых метнлнрована только одна цель (наполови ну метилированные), а при последующих репликациях-неме ти лированные ДНК. Ваша идея заключается в том, чтобы, нача! с полностью метилированной ДНК, индуцировать се реплика . цию <л т)гго. Затем вы можете определить транскрипцию в репии.
цировавшейся ДНК, обработав ее 1Эрп1, которая разрежет нерви, лицировавшуюся ДНК !полностью метилированную) и таке. образом остановит транскрипцию, но не расщепит реплиашрв вавшуюся ДНК 1метилированную наполовину или совсем нема ' тилированную). Для проверки того, будет ли работать аналитическая ча св вашей схемы, вы конструируете ген несколько большего размера ' чем нормальный ген 53-РНК (макси-ген), чьи транскрипти можно отличить от транскриптов нормального гена 5Я-РНй< (рис. 10-11, А).
Затем вы готовите смесь полностью метилирь ванного максигена с наполовину метилированным нли немети лированным нормальным геном и определяете их транскрнпп ии до и после обработки Ррл1, МЬо1 и БапЗА. Специфично си. рсстриктаз приведена на рис. 10-11, А, а результаты эксперимси тов по транскрипции-на рис. 10-11,Б. Для определения воздействия реплнкапии на транскриппии вы собираете транскрнпционные комплексы на полностью мети. лированном макси-гене, индуцируете рсплнкацию и изучаеп транскрипционную активность до и после обработки рестрикпа, замп.
Результаты приведены па рис. 10-11,Е. А. Влияет ли уровень метилирования гена 5Я-РНК на транскрии цию? Объясните ваш ответ. Б. Совпали ли результаты транскрипции с матриц, обработана ьв разными рестриктазамн, с ожидаемыми? Объясните ваш ответ. ' В. В вашем опыте реплицировалась примерно половина молоку! ДНК. Указывает ли характер транскрипции после реплика ии и расщепления рестриктазами на то, что транскрипционнн1. комплекс остается связанным с геном 5Б-РНК в ходе реплнкаций< Г. В данных опытах было четко показано, что более 90% молев?! образовывали активные транскрипционные комплексы и 50% молекул реплицировалнсь. Как изменились бы ваши данные, сои бы только 50% молекул образовывали активные транскриппиои ные комплексы? Изменились ли бы ваши выводы? Вы изучаете значение метилировання ДНК для регуляции зы прессии генов, используя в качестве тест-снстемы ген у-глобии человека.
Глобнновую мРНК можно обнаружить, когда этот пп' встроен в геном фибробластов мыши, хотя и в гораздо меныви количествах, чем в эритроцитах. Если, однако, ген предварв тельно метилировать по всем 27 сайтам СО, его экспресса полностью блокируется. Вы используете эту систему для отв сп' на вопрос о том, достаточно ли одного ключевого сайта метил .
рования для регуляции экспрессии глобина. Для получения нескольких отличающихся друг от др?п конструкций гена у-глобина, не метилированных в различив! участках, вы используете комбинацию методов сайт-специфи. Рве. 10-11 ~а транск 1зддача 1! зующнйс! и содержа Указаны вительны' рпктазам! наиболее выявляем Б. Метил гена ?-гл< части ген том. Вни< ио шесть мотора. '. ?-Глоб пад приведен процент с пе содери саитов. Контроль генной экспрессии 177 А. Карта раотрикции Н1КН Сао Сто о- 1Х 1Е в С1о Сто нра нин Нра Экаон 3 Экаоны 1 и 2 1,8 2,0 2,0 1,3 6. Конструкции Траиокрияция 10 11 1213 1415 1О Пооладоваталаности Сц вокруг яроиотара 1-ип Вш 10-12. Влияние метялированнх ш транскрипцию гена у-глобяна !!сдача 10-20). А.Фрагмент, обра- срхцпйсэ прн обработке Н)пс)11! аадсржащпй ген у-глобяна. унзпсы святы расщепления чувст- впедьпымя к метнлнрованяю рест- ратаэамп СГо1 н НраН н размеры нхболао крупных фрагментов, шндаоыых в геле,(см.
Рнс. !0-13). В Метплпроэанные конструкции пн 1-глобяпэ. Метнлнрованные пши гена отмечены черным цве- юм. Внпзу показано более подроб- аа шесп, сайтов СН вокруг про- хшора. Уровень экспрессии РНК ргдобппа дпя каждой конструкции дрхведен справа н выражен как арадант от экспрессии конструкции, н содержащей метнлнрованпых шрюв. ческого мутагенеза и затравочного синтеза в присутствии 5-метил-с)СТР. Эти конструкции приведены на рис. !0-12; метилированные области отмечены черным.
В нижней части рисунка показано расположение вокруг промотора шести сайтов метилирования. В конструкции Е не метилированы сайты 11, 12 и 13, в конструкпии Р не метилированы сайты 14, 15 н 16, в конструкции Р все шесть сайтов остаются неметилированными. Вы вводите эти конструкции в фибробласты мыши, выращиваете линии клеток с отдельными конструкциями и измеряете уровень синтеза в них РНК у-глобина, который сравниваете с уровнем синтеза в линиях клеток, содержащих полностью неметилированную конструкцию (рис. 10-12, Ь). Для проверки того, что характер метнлирования наследуется точно, вы получаете препараты ДНК из линий клеток, содержащих конструкции В, С н Р, и обрабатываете их Ншс)111 в сочетании с СГо! или с Нра11.
СГо1 и Нра11 не расщепляют узнаваемые ими участки, если последние метилированы. Сайты расщепления для этих ферментов показаны на рис. 10-12, А, где указаны также размеры образующихся рестрикционных фрагментов, превышающие 1 т. и. н. Вы разделяете рестрицированные препараты ДНК в геле и визуализируете их путем гибридизации с мечеными Н)пс)П1-фрагментами (рис. ! 0- ! 3).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
