Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 42
Текст из файла (страница 42)
При этом из-за натяжения цепей репликационные глазки смыкаются, в результате его дочерние дуплексы лежат бок о бок. Мешочек с прилипшими к нему цепями ДНК укрепляют на предметном стекле, покрывают фотоэмульсией и экспонируют от 3 до б мес. Меченая ДНК проявляется в виде треков из зерен серебра. Для синхронизации клеток на этапе начала 8-фазы вы подвергаете их предварительной обработке. В одном варианте опыта вы прекращаете блокаду синтеза, применяемую для синхронизации, и немедленно вводите 'Н-тимндин, Через 30 мин вы промываете клетки и заменяете среду, так чтобы концентрация метки составляла около 30% от первоначальной.
Еще через 15 мин вы готовите ДНК для радиоавтографии. Результаты этого эксперимента приведены на рис. 9-14, А. Во втором варианте опыта вы прекр'даете блокаду синтеза, применяемую для синхронизации, затем ждете 30 мин и только тогда добавляете 'Н-тимидин. Через 30 мин инкубации с 'Н-тимидином вы вновь меняете среду, чтобы снизить К, >т- а~и- :оке та ~а. одинаковой скоростью, из чего следует, что упаковка ДНК в хроматнн не препятствует процессу репликации.
Элементы АКЯ у дрожжей содержат, по-видимому, многочислен- ные копии АТ-богатой консенсус-последовательности (обобшен- ной последовательности) в пределах участка размером 100 нуклсо- тидов. Эукариотам необходимы два типа ДНК-полимераз: ДНК-полиме- раза альфа на отстающей цепи и ДНК-полимераза дельта на ведущей пепи. Как и большинство белков, гистоны непрерывно синтезируются па протяжении интерфазы, но связываются с ДНК для образования нового хроматина лишь во время Я-фазьь Цепь теломеры с высоким содержанием О, всегда расположенная на 3'-конце молекулы ДНК, может загибаться назад, образуя особую структуру со спаренными основаниями Π— О, которая и защищает конец хромосомы. Области хромосом реплицируются как отдельные крупные едини- цы, при этом разные области каждой хромосомы реплицируются в строго определенном порядке.
У самок млекопитающих две Х-хромосомы,из которых активна лишь одна, в ходе $-фазы реплицируются одновременно. Гены, активные только в некоторых типах клеток, обычно реплн- цируются на более ранней стадии митоза в тех клетках, где они активны, и на более поздней стадии †клетках других типов, Большая часть ОС-богатых полос (й-сегменты) реплицируется в первой половине Я-фазы, а большинство АТ-богатых полос (О-сег- менты) реплицируется во второй половине Я-фазьь Если клетку, находящуюся в Я-фазе, слить с клеткой, находящейся в О,-фазе, синтез ДНК в О;ядре нндуцируется; если же клетку в Я-фазе слить с клеткой в О,-фазе, то в О,-ядре синтез ДНК не стимулируется. 142 Глава 9 Рис. 9-14. Результаты радиоавто- графин в эксперименте по изучению репликацни ДНК в культивируемых клетках !задача 9-!8). А, Клетки помечены сразу после прекращения синхронизнрующей блокалы. Е.
Клетки помечены через 30 мин после прекращения синхронизирую- щей блокады. ае км 9-19 (АКЗ), сообщающие стабильность плазмидам дрожжей, являюв точками начала репликации. Однако доказать это весьма сложи Трудность состоит главным образом в выделении достаточна для анализа количества определенных реплицирующихся мелек) ДНК.
Это препятствие можно обойти, используя двумерик гель-электрофорез, который позволяет разделить молекулы ДН по размеру в одном направлении и по форме — в другом. Из-за тп что у реплнцирующихся молекул имеются разветвления, ез, мигрируют во втором направлении медленнее, чем лннейвк молекулы с той же массой. Разрезая реплицирующиеся молекул..
рестриктазами, можно получить ряд различных разветвленвк форм, дающих в двумерном геле характерное распределен? (рис. 9.15). Вы используете этот метод для изучения репликации плазмвл содержащей АКВ1. Чтобы увеличить количество реплнпнрующв,' ся плазмидных молекул, вы синхронизируете культуру дрожи' и выделяете ДНК из клеток, находящихся в Я-фазе. Затем к. обрабатываете ДНК ферментом ВВ1П или Руп1, которые раза' зают плазмиду, как показано на рис.
9-1б, А. Вы разделяете фри менты ДНК с помощью двУмеРного гель-электРофоРеза и посйуве. 9 1б г блот-гибридизации с радиоактивно меченной плазмидной Д)!)гййб! (А) и проводите радиоавтографню, чтобы можно было увидеть резу~йль-электр тат (рнс. 9-16, Б).
;:обработана А. Что представляет собой интенсивное пятно, возникшее в резунуи Рт"1 1о) концентрацию меченого тимидина, и инкубируете клетки еа 15 мин. Результаты второй серии экспериментов приведены ! рис. 9.14, Б. А. Объясните, почему в обоих экспериментах некоторые учасп треков оказались плотно заполненными гранулами серебра (те! ные участки), а другие -менее плотно (свет!!ма участки).
Б. В первом опыте каждый трек имеет центральную темную чаа и светлые участки на каждом конце. Во втором опыте светла участок есть только на одном конце каждого трека. Объясзщз почему наблюдается такая разница в результатах этих двух акса риментов. В. Определите скорость движения репликативной вилки (мкм)мн в этих экспериментах. Совпадают ли результаты„ получешв в двух опытах? Можно ли использовать эти дашзые для тос чтобы определить, сколько времени необходимо для репликащ всего генома? Полагают, что автономно реплицирующиеся последовательноа Рве.
9-15. форез мо нием 1А), ным репл двумя ра: метрично цнонным В верхне! жены про зующиеся условногс ! т.п. н, 1 показано, процесса ются в ге Клеточное ядро 143 Е. СИММЕТРИЧНЫЙ ГЛАЗОК ж одна вилкА В. ДВЕ ВИЛКИ Г. АСИММЕТРИЧНЫЙ ГЛАЗОК Первое направление (масса) ге а в а оп а Я А. ПЛАЗМИДА Е. РАЗДЕЛЕНИЕ В ГЕЛŠ— а Первое направление Рен! Нб. Строение плазмнды 31 (А) н результаты двумерного .зяектрофореза агой плазмиды, Я)брябогавной рестриктазами ВЕ111 И УМ1(В) (задача 9-19).
а ~ц и я х о л. к ( В е с йк, 9-15. Двумерный гель-электро- (вусз молекул с одним разветвле- аеы (А), симметрично расположсн- яни репликационным глазком (Ь), ири разветвлениями (В) и асим- ипрвчно расположенным реплика- июввыы глазком (Г) (задача 9-19).
В хсрхней части рисунка изобра- хмы промежуточные формы, обра- ззюивсся в процессе репликацин Рловвого фрагмента длиной 1г,л.н. В нижней части рисунка хохазаво, как такие интсрмеднаты хроцесса репликацни распределя- ююя в геле. тате гибридизации и расположенное на обоих гелях в положении, соответствующем 4,5 т.п.н. (рис. 9-16,6)? Б. Доказывают ли результаты этого эксперимента, что Айо! является точкой начала рспликации? Объясните ваш ответ. В. На том геле, где разделяли материал, обработанный Рчп1 (рис. 9-16,6), в дугообразной линии зоны гибридизации имеется разрыв. В чем причина этого? 9-20 Одно из основных правил репликации эукариотических ДНК состоит в том, что ни одна хромосома или ее часть не может реплицироваться более одного раза за клеточный цикл.
Для того чтобы вирусы эукариот могли образовать свои многочисленные копии за один клеточный цикл, они должны обойти или изменить это правило. Например, вирус животных ЯЧ40 за один цикл инфекции образует 100 000 копий своего генома. Чтобы достичь этой цели, вирус синтезирует специальный белок, называемый Т-антигеном (в связи с тем, что сначала он был выявлен иммунологическими методами). Т-антиген связывается с точкой начала рспликации вируса ЗЧ40 и каким-то образом инициирует синтез ДНК.
144 Глава 9 Ряс. 9-17. Типичный пример ллаз- миды, содержащей точку начала роплвкацяи вируса ЯЧ40, после янцубации с Т-антигоном, белком, связывающимся с однопелочеч- ными молекулами (888-белок) в АТР (задвча 9-20). нтиген й Х ЗО я $ ~ зо О двукцепочечнвя т — Одноцепочечная дНК, покрмтан Зав.венком Рае. 9. в обла рхруж, щвх б~ А Б В Г Стадии развития ндца С( 1.а 1О 1З !3 14 9-21 ги чарна ичеака а папка (7,4 т.п.и.) Контропьнмь ген (2,З т.п.н.) Ряс.
9-18. Блог-гябридязапвя гена белка хориона в контрольного тена на разных стадиях развития яйца (задача 9-2!). И-М21 Механизм, посредством которого Т-антиген инициирует репла;( кацию, изучали )п ч((го. Если в присутствии очищенного Т-антигр) на, АТР и ББВ (япд)е-з(гапд Ь(п(((п8)-белка, связывающегося с одни( цепочечной ДНК, инкубировать кольцевую плазмидную ДНК',.
несущую точку начала репликации ЪЧ40, то с помо(цью электрон'" ного микроскопа можно наблюдать частично расплетенные струи: туры (рис. 9-17). Когда одного из этих компонентов нет, расши~, генные структуры отсутствуют. Расплетания не происходит и й том случае, если в точно такой же плазмиде в точке начал(' репликации имеется делеция 6 нуклеотидов.
При очень осторок( ном выделении, не допускающем появления одноцепочечных разр рывов (т.е. когда выделена ковалентно-замкнутая кольцеви ДНК), подобных расплетенных структур пе наблюдается, пох(( в инкубационную смесь не добавлена топоизомераза 1. Какой дополнительной активностью кроме сайт-специфическом( связывания с ДНК должен обладать Т-а(ггиген? Какую роль можа,' играть такая активность в инициации синтеза ДНК? Эти эксперименты показывают, что структуры, наблюдаемые с пр', мощью электронного микроскопа, расплетены в области точи~ начала репликации вируса БЧ40. Положение этой точки в геном(1 БЧ40 известно. Как с помощью рестриктаз доказать, что згв) именно точка начала репликации, и определить, в одном или дв)й направлениях происходит расплетание этого участка? Если плазмидная ДНК представляет собой ковалентно замкнутр( кольцо, то для чего нужна топоизомераза 1? (Топоизомерав 1 вносит в двуспиральную ДНК одноцепочечные разрывы и затею быстро их зашивает, так что разрывы существуют лишь в течеив очень короткого промежутка времени).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
