Г. Юинг - Инструментальные методы химического анализа (1115206), страница 81
Текст из файла (страница 81)
Интервал молекулярных масс соедине- ний, удерживаемых гранулами р-стирагеля Тв стого полимерного материала, чаще всего это уже упоминавшийся ранее сополимер стирола и дивинилбензола (ПСДВБ) и разнообразные полиакриламидные гели. Эти материалы имеют поры гораздо больших размеров, чем цеолиты, и перед использованием их следует привести в состояние равновесия с растворителем, выбранным в качестве элюента. Растворитель вызывает значительное набухание частиц, что служит характерным признаком геля. Ситовый эффект настолько велик, что его удобно выразить через молекулярную массу неудерживаемых («исключаемых») гелем соединений. В табл.
21-3 приведны такие данные для некоторых сортов )4-стирагеля — сополимера стирола и дивинилбензола, выпускаемого фирмой (1(га1егз Аззос)а1ез. Пределы исключения довольно широки, потому что заметное влияние оказывает форма молекулы (глобулярная, линейная, согнутая и т. д,), На рис. 21-6 приведена типичная хроматограмма, полученная Рис. 21-6. Хроматограмма стандартной смеси полистиролов в толуоле, полученная методом ГПХ (тЧа1егз Аззос(а1ез). Отмечены малярные массы, соответствующие отдельным пикам. Введено 75 мкл стандартной смеси; 4 колонки ЗО смм7,6 мм (внутр. диаметр) с Р-стирагелем, 1О' А; длительность анализа 10 мин; температура окружающей среды; объем сифона 2 мл. методом ГПХ. Обратите внимание, что первым элюируется со- единение с наибольшей молекулярной массой, поскольку оно не удерживается гелем. До сих пор мы рассматривали лишь изократические методы хроматографического разделения, т.
е. такие методы, в которых элюирование ведется только одной жидкой фазой. Изократические методы достаточно удобны для разделения подобных ве(цеств, когда можно оптимизировать условия путем соответствующего подбора неподвижной и подвижной фаз. Однако для разделения сложных смесей, компоненты которых могут сильно различаться по степени полярности, эти методики не вполне пригодны. Времена удерживания различных компонентов (или величины й') слишком разнородны, так что первые их пики, как правило, группируются вблизи стартовой точки, а последние пики настолько уширяются, что их трудно измерить точно. Эту сложную проблему можно в значительной степени решить при помощи градиентов элюирования, используя смесители, как показано на рис. 21-1.
Состав растворителя изменяют постепенно по мере проведения хроматографического разделения, начиная со «слабого» растворителя (дающего большие величины 74') и кончая «сильным» растворителем (дающего наименьшие величины 74'). В результате разрешение пиков на хромограмме заметно улучшается. На рис. 21-7 показаны хроматограммы одной и той же смеси, полученные при элюировании в изократическом и градиентном режимах (1). Пример градиентного элюнрования в ионообмеиной хроматографии приведен на рис. 21-4, жидкостнаа хроматографии 443 442 Глава 21 Кто«та Зо пектсра О,аоа яраса Иогючнок Зкран одета 0,400 линэа " ;оЛ й й ОДОО ~ О,10О о,ооо и и и ~: В З Длина долны, нм эталон оптически нуль Ресулирсдка нуля а абаз элюагпа Ячс""ка „Лагоса йвклян ароэма ПрссаждННЫй (ндослсльэуе- .- Йьа(1 луч От истачнока одета Фопго- элемснт Рис.
21-9. Трехмериан диаграмма эдюироиании бензола н ацетонитриле с ЖХ- колонки, Детектором служит «гребенка» фотодиодоа 11!1. щего из колонки элюата обладают различной поглошающей способностью. В работе [1 Ц описан спектрофотометрический детектор (1 Ц с «гребенкой» из 211 фотодиодов на подложке из одного кремния, допускающий одновременное измерение большого числа полос с узкой длиной волн.
Полученную таким способом информацию обрабатывает компьютер (со скоростью 22500 экспериментальных точек в секунду), он же хранит их в памяти для последующего построения графика. На рис. 21ой показан пример трехмерной спектрохроматограммы, которую можно получить из этих данных. Рефрактометрнческне детекторы. Другим важным детектором в ЖХ является рефрактометрический детектор, позволяю. щий уловить разницу в величинах показателей преломления всего лишь в одну десятимиллионную часть, что соответствует содержанию органических соединений в воде порядка нескольких микрограммов на миллилитр (эта оценка основана на данных, приведенных в справочнике для мальтозы при 25 'С), Это неселективный способ обнаружения, чувствительность которого зависит только от разности величин показателей преломления растворителя и растворенного вещества.
Преимущество рефрактометрического детектора состоит в том, что его можно применять при работе с растворителями, физические свойства которых (например, поглощение в УФ-области) не позволяют использовать другой вариант обнаружения. Недостатком является невозможность применения градиентного элюирования, потому что изменения показателя преломления из-за программирования состава растворителя полностью перекрывают сигналы, обусловленные элюируемыми компонентами.
На рис. 21-10 показаны принципы работы двух рефрактометрических детекторов. В основе работы модели а лежит из- рис 2! 1О рефра«гометриче не детекторы длн ЖХ фирм 1уа!ега А55001а!еа (а] и ьаьога!огу Ра!а Сон!го! (б), меренне угла смещения светового потока при прохождении через две призмы, заполненные жидкостью.
Если жидкости идентичны, смешения не происходит. Однако изменение величины показателя преломления даже на несколько миллионных долей позволяет определить изменение угла потока. Фотодетектор чувствителен к направлению светового потока, а не к интенсивности его, поэтому выходной сигнал зависит от того, под каким углом входит световой поток. Для установки нуля пригодна простая стеклянная пластинка, которую можно повернуть так, чтобы немного сместить световой поток. Другая схема детектирования (модель б) основана на измерении относительной интенсивности света, отраженного и про.
444 Глава 21 Жидкостная хроматография 445 шедшего через границу двух прозрачных сред. Поток элюата пропускают через узкий проход между одной гранью стеклянной призмы с углом 45' и стальной пластинкой. Параллельный пучок света входит в призму, как показано на рисунке; он частично отражается, а частично проходит через межфазную границу и дает световое пятно на задней стенке стальной пластинки. Стальную пластинку наблюдают в телескоп, соединенный с фотоэлементом. Математически можно показать, что если угол падения выбран правильно (немного меньше, чем критический угол полного отражения), то интенсивность наблюдаемого излучения линейно зависит от показателя преломления жидкости.
Источник света и фокусирующую систему монтируют на рукоятке, которую можно поворачивать на маленький угол вокруг призмы для начальной регулировки. Чувствительность этих двух рефрактометрических детекторов примерно одинакова, и они способны обнаружить изменение в показателе преломления в одну десятимиллибнную часть.
Детектор отклоняющего типа (рис. 21-10, а) более удобен в работе, но у него наблюдается меньший диапазон линейности, чем у детектора, изображенного на рис. 21-10, б. Другие детекторы. К УФ-детекторам примыкает детектор, измеряющий флуоресценцию, возбуждаемую излучением ртутной лампы при 254 нм [12), Этот высокоселективный и чувствительный детектор особенно важен при проведении биохимических исследований, однако при проведении здесь измерений необходимо учитывать возможность тушения флуоресценции другими компонентами раствора или растворенным кислородом. Еще один способ идентификации и количественного анализа компонентов элюата основан на использовании реакционного детектора. Поток элюата, поступающий из колонки, постоянно смешивается с реагентом, взаимодействующим с определяемым компонентом с образованием соединения с характеристическим излучением или флуоресценцией. Затем объединенный поток проходит через подходящий оптический детектор.
Применение этого принципа показано иа примере определения белков и аминокислот с использованием флуорескамина (флуорама) [13). Это многоядерное ароматическое соединение реагирует с первичными аминами с образованием продуктов, сильно флуоресцирующих при 475 нм после возбуждения при 390 нм. В детекторе по диэлектрической проницаемости [14) узкое пространство между двумя металлическими электродами служит конденсатором. Поступающий из колонки элюат, проходя через этот канал, вызывает изменение емкости в соответствии с величиной своей диэлектрической проницаемости е. Растворители, применяемые в ЖХ, значительно отличаются по величинам е, равным примерно 2 для симметричных молекул типа бензола или циклогексана и превышающим !80 для таких высокополярных соединений, как метилформамид.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
