Г. Юинг - Инструментальные методы химического анализа (1115206), страница 30
Текст из файла (страница 30)
Монохроматоры могут использоваться в одной или обеих системах или могут быть заменены светофильтрами. Приборы с монохроматорами в обеих системах называются спекгрофлуорпмеграми; в качестве примера можно привести спектрофлуориметр фирмы Рег!с!и-Е!пег модели МРР-44В, представленный на рис. 6-5. Модулированный поток излучения, испускаемый ксеноновой лампой мощностью 150 Вт, проходит через монохроматор Черни — Тернера и направляется на кварцевую кювету, где частично поглощается пробой. Часть флуоресцентного излучения направляется во второй монохроматор. Определенная доля пер- Рпс.
6-5. Схема спектрофлуориметра фирмы Рег)г!п-Е!гпег !модель МРР-44В) (Регып-Е!гпег Согрога!!оп), Молекулярная лгомииесцеиция !57 пичного потока отклоняется от основного пути и контролиру ется с помощью вспомогательного детектора, что позволяет вводить поправку к показаниям основного фотоумножителя на изменение интенсивности ксеноновой лампы при сканировании длин волн. Работа на спектрофлуориметре обычно состоит из ряда операций.
В результате ориентировочных предварительных исследований выбирают подходящую длину волны в спектре испускания и настраивают второй монохроматор на эту длину волны. Затем записывают спектр возбуждения на первом монохроматоре. Аналогично получают спектр испускания сканированием на втором монохроматоре, настроив первый на соответствующую длину волны. Для большинства веществ изменение выбранной длины волны на первом монохроматоре мало влияет на спектр излучения, как бы далеко ни отстояла она от максимума.
Спектрофлуориметры используются для выбора условий определения и изучения влияния мешающих веществ, а также для выполнения серийных анализов. В последнем случае для повышения точности результаты следует сравнивать с результатами, полученными на том же приборе для стандартных растворов. Часто спектры, полученные на разных приборах, отличны друг от друга прежде всего вследствие изменения длины волны излучения источника, абсолютной чувствительности детектора и эффективности монохроматоров. Наблюдаемые спектры представляют некую комбинацию спектральных свойств вещества и ложных сигналов, даваемых прибором. Такие отклонения особенно существенны при измерении квантового выхода флуоресценции.
Спектрофлуориметр можно откалибровать путем строгого сравнения со стандартными источниками и термопарой или предварительной калибровкой фотоумножителя. Полученные таким способом поправки могут быть довольно большими: поправочный коэффициент изменяется от значения менее единицы до значения 50 или выше !7) (рис. 6-6).
Для того чтобы исключить многие неудобства этого метода, для сравнения используют флуоресцирующее стандартное вещество, в качестве которого рекомендован !8) хелат алюминия с азокрасителем понтахромовым черно-синим К. Известно, что родамин 66 обладает характерным откликом на возбуждение в широком интервале длин волн !220 — 600 нм) и, следовательно, может использоваться как счетчик фотонов, что облегчает калибровку фотоумножителя !91 Использование способов калибровки, описанных в упомянутых выше работах, в будущем должно привести к уменьшению сообщений о «нескорректированных» спектрах. 166 Глава 6 Молекулярная люминесценция 159 ъ О гс о к о Е 50 лю асо Длили беллы, нм пю Рис.
6-6. Скорректированный и неско(!ректироваиный спектры возбуждения хинина (О,1 мкг/мл) в 0,06 М НзБО! 17). Как показано на рис. 6-5, спектрофлуорнметр не является двухлучевым прибором в том смысле, в каком этот термин используется в абсорбционной спектроскопии. Второй фотоумножитель служит только для корректировки изменений режима лампы. Фон, возникающий из-за флуоресценции растворителя и реагентов или из-за рассеяния света частицами пыли и т. п., определяют путем измерения холостой пробы и затем вычитают; эту операцию легко выполнить на современных приборах с микропроцессорной техникой. Флуориметры Для аналитических целей часто не требуется разрешения пиков флуоресценции, как, например, при добавлении реагента, селективно реагирующего с определяемым веществом с образованием флуоресцирующего производного. Тогда отпадает надобность в дорогих монохроматорах, их можно заменить светофильтрами.
На рис. 6-7 представлен простейший прибор, в ко- тором используются два све- Р! Кюдегпа тофильтра: /г!, пропускающий УФ и задерживающий видимое излучение, и гз, поглощающий любое УФ-излучение, попавшее Л2ног в детектор, и пропускаю!ций леле Е'з видимое излучение. Этот упро- недгемг"и/гп щенный флуориметр может Г ~ Фсипиметь более высокую чувстви- уннсгчеела тельность, чем спектрофлуориметр, так как через свето- Рис. 6-7. простой флуориметр с возфильтр проходит большее ко- буждением под прямым углом. личество света, чем через монохроматор. Мощность питающего лампы и фотоумножитель устройства в обоих типах приборов должна быть строго стабильной.
Применения Особенностью флуориметрии является ее высокая чувствительность, которая часто в 10' — 10' раз превышает чувствительность абсорбционных методов. Кроме того, этот метод более селективен, поскольку флуоресцирует меньшее число соединений, чем поглощает. К флуоресценции в видимой области способны в основном два класса веществ: 1) большое число минералов и неорганические твердые люминофоры и 2) органические и металлоорганические соединения, обладающие интенсивным поглощением в УФ-области. Что касается веществ первого класса, мы упомянем лишь метод определения следов урана в горных породах и природных водах [10). К растворенной пробе добавляют Са(ХОз)з и затем (медленно) ХН4г.
Образующийся при этом осадок Сага захватывает уран в виде фторида. Осадок отфильтровывают, высушивают, прокалнвают при 800 'С, затем измельчают. Получившуюся пудру спрессовывают в таблетки и исследуют на флуориметре. Как показано в цитируемой работе, возбуждение проводилось аргоновым ионным лазером при длине волны 488 нм. По данным авторов, предел обнаружения составляет 0,01 пг/мл.
В неорганической химии флуоресцентный анализ применялся, например, для определения следовых количеств кадмия в виде соединения с кальцеином, являющегося карбоксиметильным производным бис(диметиламннометил) флуоресцеина (1Ц. Кадмий предварительно отделяют от мешающих ионов методами ионного обмена. Флуоресценцию измеряют в 0,5 М растворе КОН при 520 нм с возбуждением при 490 нм; предел обнаружения составляет 2,2 нг/мл.
Глава 6 Молскзлярная люминесценции (6( В органической химии флуоресценция применяется в основном для определения полициклических молекул, в том числе многих веществ, имеющих значение в биохимии и фармакологии. Ниже кратко описаны две такие методики. Тиамин [витамин В~) можно количественно определить по голубой флуоресценции его продукта окисления — тиохрома [12). К пробе добавляют фосфатазу — фермент, вызывающий гидролиз фосфорного эфира тиамина, который часто присутствует в пищевых продуктах. Фосфатазу и другие нерастворим ые вещества отфильтровывают, а фильтрат разбавляют до изля вестного объема. Отбирают две аликвотные порции: одну дл анализа, другую для приготовления холостой пробы.
К первой аликвотной порции добавляют окислитель,[феррицианид) и к обоим — ХаОН и изобутанол. После встряхивания и отделения водного слоя спиртовой раствор исследуют на флуориметре. Рибофлавин также можно определить флуориметрически [121 Интенсивность флуоресценции в большой степени зависит о точного соблюдения условий эксперимента, а также от природы и количества присутствующих примесей.
Для того чтоб ы примеси оказывали одинаковое влияние на стандартные и анализируемые растворы, используют метод стандартных добавок. При этом измеряется суммарная флуоресценция определенного количества стандарта и неизвестного количества определяемого компонента. Рибофлавин легко окисляется, превращаясь в нефлуоресцирующее вещество, которое количественно восстанавливается снова в рибофлавин, что используется в данной методике. Другая область применения спектрофлуориметрни — получее УФ-спектров поглощения очень небольших по размеру п об или очень разбавленных растворов. При этом испол уни ьзется идентичность скорректированных спектров возбуждения фл оресценции и спектра поглощения. Спектр возбуждения имеет менее топкую структуру, но зато сам метод флуоресц у вицин более селективен, чем методы абсорбциоппой спектроскопии, потому что многие примеси не флуоресцируют.
Если нельзя получить скорректированный спектр флуоресценции, метод нужно использовать с осторожностью, поскольку возможны си льные искажения, связанные с тушением флуоресценции. В этом случае следует снять еще несколько спектров при р ных концентрациях; если они идентичны, концентрационное тушение, по всей вероятности, можно исключить. В благоприятных условиях можно получить спектры поглощения растворов, содержащих нанограммовые или микрограммовые количества флуоресцирующих соединений зго 350 ззо ОО Янслрапеи 300 350 Еоа 350 380 лю Алина бояны, ни б Рис.
6-8. Спектры возбуждения н излучения флуоресценцни н синхронный спектр феиаитрена (а), антрацена (б) и перилена (в) (!3]. 6 заказ м 537 его лбо лво из о в 3 о в ' о гбо абуждение !1 )1)11 /Ь И l ./ 162 Глана 6 Молекулярная люмииесценцня 163 Фосфориметрия о 4 и м 5 и" уа йзз на нз Уз мз нз зз из и мз Я о 44 В 5 Зг м в Ы сз 0 0 ЗОО 550 400 450 500 Длина долмы, нм Рис.
6-9. Обычный (а) и синхронный (б) спектры флуоресценции смеси наф- талина, фенаптрена, антрацена, перилеиа и тетрацена 1!3). Синхронная флуориметрня. При одновременном сканировании длин волн обоих монохроматоров можно получить резко выраженный флуоресцентный сигнал [13, 14).
Пик появляется только в той области, где перекрываются спектры возбуждения и излучения. Часто самый коротковолновый пик в спектре испускания слегка сдвинут и находится в области более длинных воли, чем самый длинноволновый пик спектра возбуждения. Поэтому для получения оптимального результата между двумя монохроматорамн следует поддерживать небольшую постоянную разность длин волн (или частот (161). На рнс. 6-8 показан этот тип сигнала на примере трех ароматических углеводородов. Сдвиг длины волны составляет 3 нм.
Достоинство этого метода заключается в гораздо лучшем разрешении при исследовании смеси флуоресцирующих соеди- нений (рис. 6-9). Процесс фосфоресценции отличается от флуоресценции, во-первых, длительностью (для фосфоресценции полупериод составляет от 10-' до 10 с, а для флуоресценции — 1О-' — 10 ' с) и, во-вторых, сдвигом максимума в более длинноволновую область по сравнению с флуоресценцией.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
