Г. Юинг - Инструментальные методы химического анализа (1115206), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Эти интервалы представляют собой полупериоды существования возбужденных частиц, т. е. промежутки времени, необходимые для того, чтобы половина молекул испустила фотоны и вернулась в исходное состояние. Другими словами, возбужденное состояние флуоресцирующих молекул может продолжаться в среднем 10 — ' с, тогда как молекулы фосфоресцирующих веществ, будучи мета- стабильными, находятся в возбуждснном состоянии гораздо дольше. Молекулы, активные в рамановской спектроскопии, ие найдя подходящего уровня )ч', могут сразу же вернуться на основной электронный уровень 5о. Очевидно, что эти три процесса протекают по разным механизмам.
Флуориметрия При возбуждении (процесс 1) большинство молекул приобре- тают колебательную и электронную энергию и переходят на некоторый колебательный подуровень возбужденного электрон- Молекулярная люмявесценцня 151 150 Глава 6 и "з 2 зз Рис. 6-1. Переходы при флуоресценции и фосфоресцеиции. Рисунок .дает более детальную картину (с последовательной нумерацией) части рнс. 2-2. Переход, обозначенный буквой а, соответствует области перекрывания спектров возбуждения и флуоресцеиции, поскольку его зиергня меньше зиергин перехода б.
Переход 1Х относится к рамаиовской спектроскопии. ного состояния. Большинство таких возбужденных молекул в результате потери энергии при столкновениях стремятся перейти на самый низкий колебательный уровень (процесс П). Этот безызлучательный процесс заканчивается тем, что молекулы оказываются на возбужденном синглетном электронном уровне 5г, с которого они могут вернуться в исходное состояние с излучением фотона (флуоресценция, процесс 1Ч). С меньшей вероятностью они могут перед излучением перейти на метастабильный триплетный уровень (фосфоресценция, процессы Ч, Ч1 и ЧП!).
В любом случае молекула может в конце концов оказаться в каком-либо колебательном состоянии основного уровня. Этим объясняется, почему спектры флуоресценцим и фосфоресценции состоят из множества близко расположенных линий, по большей части в видимой области. В присутствии растворителя линии уширяются и сливаются друг с другом, в результате чего получается менее структурированный спектр, внешне напоминающий спектры поглощения в УФ- и видимои областях. Поскольку молекулы, возбужденные до колебательного подуровня электронного состояния 5„перед флуоресценцией пере- 200 250 ЗОО Збо 400 450 500 Длина долны, нн Рис.
6-2. Спектры флуоресценцин (а) и возбуждения (б) аитацена. Обратите внимание иа то, что максимулг поглощения при 250 им не имеет зеркальной симметрии [1]. ходят на свой основной уровень 5ь большая часть переходов, связанных с флуоресценцией (процесс !Ч), сопровождается меньшей потерей энергии по сравнению с абсорбционными переходами процесса 1. Однако при комнатной температуре часть молекул всегда находится на первом и втором колебательном подуровнях основного состояния. Следовательно, возможен переход (указаиный на рисунке буквой а) с такого уровня на уровень 51 с меньшей энергией, чем у перехода, обозначенного буквой б.
Поэтому, хотя основная часть флуоресцентного излучения имеет большую длину волны (энергия фотонов меньше), чем возбуждающее излучение, обычно наблюдается некоторое перекрывание, и небольшая часть испускаемого излучения проявляется в более коротковолновой области, чем самое длинно- волновое излучение спектра возбуждения. Расположение колебательных подуровней электронных уровней 5о и 5, почти идентично, поэтому спектр флуоресценции должен быть в общих чертах зеркально симметричным спектру возбуждения. На рис.
6-2 сравниваются спектры возбуждения и флуоресценции антрацена, из которого очевидно, что они зеркально симметричны (1). Переход 5а — «5, при 378 нм проявляется в обоих спектрах. Интенсивная полоса поглощения при 250 нм обязана своим происхождением переходу 5, 5х, любая молекула, оказавшаяся на электронном уровне 5х (или более высоком), переходит в состояние 5, в результате безызлучательных переходов, поэтому в спектре испускания такой полосы нет Молекулярная люминесценцня ) 63 152 Глава 6 УФ-лампа Фотозлетент а Фотазлеиенш тельно, большая часть флуоресценции) происходит в непосредственной близости от грани кюветы, на которую попадает излучение (рис.
6-3,б). В данном случае целесообразно наблюдать флуоресценцию под небольшим углом. Эта геометрия предпочтительнее также при изучении растворов, заметно поглощающих при длинах волн флуоресценции, потому что тогда испускаемое излучение проходит через слой раствора минимальной толщины. Если исследование преследует теоретические цели (например, определение квантового выхода), то лучше использовать способ наблюдения на просвет (рис. 6-3, в), поскольку в расчетные уравнения войдет меньше приближенных величин (21 Математически флуоресценция описывается более сложными зависимостями, чем поглощение, для которого существует сравнительно простой закон Бсра. С одной стороны, при прохождении через массу раствора излучение поглощается по экспонснциальному закону, С другой стороны, флуоресцентное излучение всегда, хотя бы в малой степени, поглощается раствором, но толщина слоя, через которую оно проходит; не является постоянной величиной, поскольку излучение возникает во всем объеме раствора, а не в какой-либо одной точке.
Полные уравнения имеют слишком громоздкий вид и здесь не рассматриваются, их можно найти в литературе [2, 3). В простейшем случае в разбавленном растворе находится лишь один вид поглощающих и флуоресцирующих частиц. Основное уравнение для такого случая имеет вид УФ-ламп Проба т Фоп озле нен и б 'Рис.
6-3. Конструкции флуориметров. Наблюдение излучения проводится под углом 90' (о), под небольшим углом (б) и под углом )80' (а), Р, и Ров первичный и вторичный светофильтры, один нз которых нли оба можно заменить монохроматорами. Флуоресцентное излучение возникает в пробе, поэтому оно распространяется во всех направлениях, и в принципе его можно наблюдать под любым углом. На практике используются три варианта (рис.
6-3). Из конструкционных и других соображений удобнее всего наблюдать излучение под углом 90' (рис. 6-3,а), и обычно этот вариант используется в конструкциях недорогих флуориметров. В очень концентрированных растворах поглощение большей части излучения (и, следова- Р =- РоК (1 — 10 л) (6-1) где Р— интенсивность флуоресцентного излучения, попада М щего в детектор, Р, — интенсивность падающего УФ-излучения. ножитель К, являющийся постоянной для данной системы и прибора величиной, представляет собой фактор перехода от интенсивности поглощенного излучения к той части непоглощенного флуоресцентного излучения, которая поступает в детектор; А — оптическая плотность раствора при длине волны падающего излучения. Это выражение можно преобразовать в более удобную форму, применив разложение члена 10 —" в ряд Тейлора: Р Р К Г2 30А (2,30А) (2,30А) ч и о В пеРвом пРиближении для растворов с малой оптическ " л тностью квадратными членами и членами более высоких ой степеней можно пренебречь и получить прямую зависимость 154 Глава 6 60 70 я 60 М 50 Ъ., 40 'ь 50 и 20 1О О 50 100 150 200 250 500 350 400 бенцентречая, мкгргл Рис.
6-4. Зависимость флуоресценции фенола в воде от концентрации. Рису- в к является увеличенным изображением начального отрезка основного графика. Возбуждение при нм, л 296, флуоресценцию наблюдали при 330 нм, рН 6,5 151. между интенсивностью флуоресценции г" и оптической плотно- ая в свою очередь пропорциональна концентрации. стью, которая в 2 Однако включение в расчет члена А уменьшает у числений примерно в 8 раз [4).
Очевидно, нужно оставлять столько членов, чтобы ошибка при их исключении была меньше, чем ошибка эксперимента. П и проведении серийных анализов ошибку можно уменьшить, построив градуировочный график и р р ри в. по аство ам с извест- а ией. На ис. 6-4 представлена зависимость флуоресцснции в ф - ии водных растворов фенола от концентрации ~ ), о кониз которой очсв чсвидно, что кривая почти лннейна лишь до но о цеитрации м г 10 кг/мл, а определение возможно примерн д ле стане 70 мкг1ыл. За этой точкой интенсивность падает всл д сильного поглощ лощения испускаемого излучения раствором. изме е- Т б азам, в качестве аналитического метода раким о раз ф ресценции можно использовать только дл ля очень разине флуоресцен бавленных растворов, концентрации катар р ых го авдо ниже, чем при измерении поглощения.
При измерении флуоресценции Молекулярная люминесценция 155 разбавленных растворов фотоэлемент фиксирует слабый свет на темновом фоне, тогда как при измерении оптической плотности того же раствора измеряемая величина представляет собой очень небольшое ослабление падающего излучения. Это равноценно точному определению отношения двух почти одинаковых больших чисел, что является очень неблагодарной задачей.
Область определяемых концентраций, указанная на рис. 6-4, как раз попадает в благоприятные условия измерения, поэтому чувствительность аналитического метода очень высока. Тушение флуоресценции. Так называется явление уменьшения интенсивности флуоресценции (или фосфоресценции) вследствие специфического влияния состава раствора. Тушение, происходящее в результате сильного поглощения раствором падающего или испускаемого излучения, называется концентрационным тушением или эффектом внутреннего фильтра.
Если же этот эффект вызван самим флуоресцирующим веществом, он называется самотушением; примером служит отклонение от прямолинейной зависимости при повышении концентрации фенола (рис. 6-4). Тушение может быть также вызвано безызлучательными потерями энергии возбужденными молекулами. Реагент, вызывающий тушение, облегчает переход молекул с возбужденного синглетного на триплетный уровень, с которого излучения не происходит. Тушение многих ароматических соединений растворенным кислородом протекает, вероятно, по этому механизму. В некоторых системах тушение флуоресценции может быть вызвано переносом электрона с участием возбужденной молекулы, например флуоресценция метиленового голубого тушится ионами двухвалентного железа.
Уменьшение тушения вследствие изменений в химической природе флуоресцирующего вещества иногда называют химическим тушением, Как правило, этот вид тушения зависит от рН..Например, в интервале рН 6 — 13 возбуждение при 290 нм вызывает голубую флуоресценцию анилина. При более низких значениях рН анилин существует в виде катионов анилиния, а в сильнощелочной среде — в виде анионов; причем ни та ни другая частица не флуоресцирует. Флуоресценция многих соединений зависит от температуры в большей степени, чем этого следовало бы ожидать, основываясь на опыте абсорбционной спектроскопии.
В флуориметрии трудности часто связаны с загрязнением пробы флуоресцирующими веществами, которые нельзя обнаружить большинством других методов. действительно, вода и водные растворы могут извлекать флуореецирующие вещества из резиновых и даже бакелитовых пробок и пластмассовой посуды 161 Значительные 156 Глава 6 количества тушителей флуоресценции иногда поступают и из других подобных же источников, таким примером служит загрязнение следами хрома из хромовой смеси, используемой для очистки посуды. Спектрофлуорн метры Основная особенность конструкции флуориметров заключается в наличии двух оптических систем, одна для возбуждающего, другая для флуоресцентного излучения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
