Тема 05 - Люминесценция (1114275), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

 I 0 10  lc(2)и определения квантового выхода K  I люм / I погл23.03.2014(3)63Количественный люминесцентныйанализИз (1) – (3)I люм   K I 0 (1  10  lc)Разложим степенную функцию в ряд (не писать!)z  x (1  10  y ) 11 322 xy ln10  xy (ln10)  xy (ln10)3 261144556xy (ln10) xy (ln10)  o( y )2412023.03.201464Количественный люминесцентныйанализ  lcI люм   K I 0 (1  10 )При условии, что  lc  0, 05Можем пренебречь высшими членами рядаI люм  2,303 К I 0 lc23.03.201465Чувствительность оптических приборовСпектрофотометрияФлуориметрияSфотом : Sфлуор  1 : 3 10 /(к P )6P – мощность излучения, ВтP  1 мВт  к  1104Sфотом  Sфлуор23.03.201466Отклонения от линейности вызваны1.

Невыполнениемусловия lc  0.052. Явлением концентрационного тушения(верхняя граница диапазона линейности 1  10-43. Эффектом внутреннего фильтра – поглощениемлюминофором возбуждающего излучения4. Реабсорбцией (самопоглощением) – поглощениемлюминофором собственного люминесцентногоизлучения23.03.201468Тушение люминесценции1.2.3.Под явлением «тушения люминесценции»понимают снижение квантового выходалюминесценции под действием различныхфакторовКонцентрации люминофораТемпературыВлияния посторонних веществ23.03.201469Концентрационное тушениеСнижение квантового выхода люминесценции приизменении концентрации люминофора.Причины:Ассоциация молекул (многие органическиекрасители, фенольные соединения)Миграция энергии (рост долибезызлучательной релаксации энергии междудвумя молекулами люминофора)23.03.201470Температурное тушениеRelative fluorescence intensity1.00.80.60.40.20.02030405060708090100С ростом температурыпроисходитувеличение числасоударенийвозбужденныхмолекул увеличивается долябезызлучательнойрелаксацииTemperature, 0CИнтенсивность флуоресценции Родамина 6Ж23.03.201471Тушение посторонними веществамиХимическое (статическое) тушение -разрушениелюминофоров (образование или разрушениекомплексов,Физическое (динамическое) тушение -передачаэнергии от люминофора на молекулу-тушитель1.2.23.03.2014РастворительТяжелые анионы и катионы (иодид-, бромидионы, ионы рубидия и цезия)Парамагнитные ионы и молекулы (O2)72Объекты и задачиФлуоресценция природных соединений илиобразование флуоресцирующих веществ;иммуннофлуоресцентный анализ,Изучение физико-химических свойствМикроскопияФлуоресцентная микроскопия, Конфокальная микроскопия,Проточная цитометрия и сортировка23.03.201474Количественный анализ флуориметрия1.

Определение веществ, обладающихсобственной люминесценциейполиароматические соединения,витамины (A, В1, В2, каротин)гормоны (эстрогены, адреналин, норадреналин),2. Люминесцентные реакции (аналогичнофотометрическим реакциям) – реакцииобразования люминофоров из исходныхвеществ3. Косвенный анализ (аналитический сигнал –тушение люминесценции)23.03.201475Реакция полиперилена с NO223.03.201476Количественный люминесцентныйанализ. ОбъектыАнализ объектов окружающей среды(дистанционный анализ вод и атмосферы)Определение последовательностиаминокислот в белках, нуклеотидов в ДНКСлежение за движением макромолекулИспользование флуоресцентных меток23.03.201477Качественный анализНесмотря на достаточно широкиеполосы люминесценции он возможен,если спектры люминесценции имеютхарактеристические особенности23.03.2014Полиароматические соединенияПорфириныКомплексы U(VI)Витамины78Общая схема метаболизма в клетке23.03.201479ФлуориметрияДостоинства Недеструктивный метод Низкие пределы обнаружения(10-11 – 10-12 М) Вплоть до детектированияотдельных молекул В целом, не слишком дорогое исложное оборудование23.03.201480ФлуориметрияНедостатки Достаточно малое число веществявляются люминофорами Необходима пробоподготовка Значительные требования кконтрольному опыту Большое число мешающих факторов(отклонения от закона Бера,тушение флуоресценции)23.03.201481ФосфориметрияМеньшее число веществ по сравнению сфлуоресценцией Низкие квантовые выходыПриемы Иммобилизация в жесткой матрице Использование вязких растворителей Охлаждение до низких температур (жидкийазот, 77K)23.03.201482Низкая вероятность T1-S0перехода имеет следствие23.03.20141.

Тушение становится значительным; прикомнатной температуре фосфоресценцияпрактически не наблюдается,2. Одним из главных тушителей являетсякислород!3. Метод определения кислорода в тканяхи жидкостях83Схема измерения фосфоресценцииI0ЛазерIфосДетектор23.03.201484СпектрофлуориметрРегистрирующее устройствоИсточник излучения23.03.2014Монохроматор 1(фильтр 1)ДетекторМонохроматор 2(фильтр 2)85ПриборыМонохроматоры, детекторы, система регистрации неотличается от спектрофотометрии)Источники излучения Чаще всего – УФ-источники Лампы накаливания ЛазерыТребования к источникам излучения Высокая интенсивность Стабильность Соответствие спектру поглощения люминофоровМогут быть монохроматическими(выполняются правило Каши и закон Вавилова)23.03.201486ПриборыФлуориметры (монохроматоры –светофильтры)Спектрофлуориметры (монохроматоры –дифракционные решетки или призмы)Флуориметрические приставки кспектрофотометрамФлуориметрические сенсорыФлуориметрические детекторы23.03.201487За кадром23.03.2014Идентификацияхимическихсоединений (преждевсего, органических)КоличественныйанализАнализ структурысложных соединенийОпределение физикохимическихпараметров среды88За кадромM123.03.2014M189Основные задачи ИКспектроскопии1.

Обнаружениеопределенныхфункциональных группв молекуленеизвестногоизучаемогосоединения2. Идентификациясоединений по ихспектру в областиотпечатков пальцев90Определениесостава клетки23.03.2014Прямой анализ образцовсложной геометрии (волос,кожи, волокон)91За кадромin-situ определениямикроорганизмов в объектахокружающей среды при помощи реагентов, которые меняютхарактеристики своих полоспоглощения в присутствиимикроорганизма (аналогфотометрической реакции) реагентов, которые прочносвязываются с клеткоймикроорганизма (т.н.фотометрические маркеры).23.03.201492За кадромОптроды, фототроды, зондыПогружаемы оптоволоконныеспектральные устройстваМикроанализОптические сенсорыСовременные вариантытитрования23.03.201493За кадром23.03.201494Профиль гидратации рогового слоя кожи руки23.03.201495За кадром23.03.201496Хромосомы нормальной (слева) и раковой(справа) клеток крови23.03.201497За кадромЗонд + МикроскопДетектированиеотдельных молекул23.03.201498За кадромобиземни ыва трро меми иоор радс ф деоры (виетженметры(ви с фоде рмос ирп е овктр аном иеметры изобр)аомдиРаияСистемы обработки изображений:Получение изображение объекта23.03.2014яниСпектрометры:СпектральныехарактеристикижераСпе ктровидеоспектрорадиометрыСпектрорадиометрыРадиометрыИзмерениесуммарнойинтенсивности99Зондирование лидаром городского аэрозоля23.03.201410023.03.20141013D-карта (разрешение 4 м) на основегипервидеоспектроскопии23.03.201410223.03.2014103Варианты детектированияВариант А – наиболее распространенный.Люминесценция измеряется под углом 900 кнаправлению света от источника23.03.2014104Вариант Б – сильнопоглощающиеобразцы, твердые тела23.03.2014105Варианты детектированияВариант В – фосфоресценция, малые квантовыевыходы23.03.201410623.03.2014107Свет отдельного единичного излучателявсегда поляризован,ЕН23.03.2014108Молекулы люминофоров оптическианизотропны, поэтому люминесцентноеизлучение отдельной молекулы частичнополяризовано23.03.2014109При большом количестве хаотическирасположенных излучателей нетопределенного направления вектора Е,т.е.

свет деполяризован23.03.201411023.03.2014111Для крупных молекул основное движение –вращение, что приводит к определенномусоотношению плоскостей поляризации влюминесцентном свете23.03.2014112Структуры трейсеров23.03.2014113Кривые разведения при использовании моноклональнойсыворотки и синтезировыных трейсеровNP92-EDFNP93-EDF300250200mP15010050001001000Dillution of MAB23.03.201410000100000114Пути расхода поглощенной энергииДонорАкцептор23.03.2014116Теория индуктивно-резонансногопереноса энергии (Вавилов-Фёрстер)1.

D + hDa  D*Возбуждение донора2. D*  D + hDfФлуоресценция донора3. D* + A  D + A* Перенос энергии4. A*  A + hAfФлуоресценция акцептора23.03.2014117W ( R) 1 R1  R 06W - вероятность переноса энергии,R0 – расстояние, при котором W = 0.5(радиус Ферстера)23.03.2014118Расстояние между группами – переносэнергииR023.03.2014АR0119Проточная цитометрияКлетки по одиночке вводятся в поток впроточной кварцевой кювете, где онипересекают сфокусированный световой пучок.Источник света возбуждает молекулыфлуоресцирующих красителей, связанных сразличными клеточными компонентамиСвет, испускаемый красителями, регистрируюти обрабатывают23.03.201412123.03.2014рассеяние света на малые углы, на угол 90°,интенсивность флуоресценции, объемклетки, поглощениеЭти параметры позволяют проводитьразделение клеток по размерам, форме,состоянию клеточной мембраны ихарактеристикам цитоплазмы.12223.03.2014123MoFlo®скорость сортировки составляет более 70000 клетокв секунду с одновременным измерением 32параметров и чистотой выхода более 99%.23.03.2014124Флуоресцентные зондыСоединение, которое обладаетфлуоресценцией, зависящей отусловий средыДобавляется к исследуемой системе, например,биологической мембране, извне и не образует с нейковалентной связиИз параметров флуоресценции зонда извлекаютинформацию о системе (диэлектрическуюпроницаемость и вязкость)23.03.2014126─+μвhνa+ ─μ023.03.2014─+hνf+ ─127Обычно в биологическихэкспериментахДипольный момент при возбуждениивозрастаетПроисходит сдвиг спектра флуоресценции вдлинноволновую область, зависящий отдипольного момента растворителя иподвижности его молекулПо сдвигу максимума флуоресценции можноизучать полярность среды (например,липидов мембран)23.03.2014128Флуоресцентные зондыЧувствителен кэлектрическомуполюO–OSЧувствительны кполярности окруженияOCH3OH CHN3NOH C3O1-анилинонафтален-8-сульфонат(АНС)3-метоксибензантрон (МБА)23.03.2014Диметиламинохалкон (ДМХ)129АНС – заряженный зондO–OS23.03.2014OHNСвязывание с мембранами зависит отповерхностного заряда мембран.С ростом положительного заряда связываниерастетЗонд для изучения заряда на мембранах ибелковых молекулах130АНС флуоресцирует только внеполярной средеАНС¯АНС¯Липосома из нейтральныхлипидовАНС — в липиде.

Флуоресценцияяркая.23.03.2014Липосома, заряженнаяотрицательноАНС — в воде. Флуоресценцияслабая.131Флуоресценция АНС100F (отн. ед.)8060400200400600800Содержание жирных кислот в липосомах (mM)23.03.20141000132.

Характеристики

Список файлов лекций