Н.А. Юрина, А.И. Радостина - Гистология (1112199), страница 50
Текст из файла (страница 50)
Затем, помешивая, нагревают их в песочной бане до тех пор, пока капля, нанесенная на предметное стекло, не будет застывать в твердую, как стекло, массу (способ Колюччи). При з а к л ю ч е н и и ненаклеенных целлоидиновых срезов после просветления в ксилоле их вылавливают на предметное стекло. При этом предметное стекло опускают в ксилол, подводят под срез, расплавленный срез придерживают за верхний край препаровальной иглой и вытаскивают вместе со стеклом.
Если срез вытащить из ксилола, а потом пытаться расправить его на стекле„он может быть безнадежно измят. Если срез наклеен на предметное стекло (например, парафиновые срезы), стекло со срезом после просветления извлекают из ксилола и обтирают с обратной стороны и по краям сухой чистой тряпочкой. На срез наносят каплю канадского бальзама и накрывают его покровным стеклом. Чтобы избежать попадания под покровное стекло пузырьков воздуха, необходимо соблюдать следующие правила: каплю бальзама наносят на край среза, затем покровное стекло ставят у края капли на предметное стекло под углом в 45', при этом бальзам растекается по краю покровного стекла (рис. 81). Свободный край покровного стекла придерживают препаровальной иглой и медленно опускают покров- 21 В Рис.
81. Техника заключения срезов (по Д. Кисели, 1962). ное стекло на срез. Бальзам при этом вытесняет воздух и растекается тонким слоем под покровным стеклом. Если бальзама было взято недостаточно и между стеклами остался воздух, можно нанести каплю бальзама у того края покровного стекла, где имеется воздух; бальзам затечет под стекло. Заключенные препараты оставляют для подсушивания в горизонтальном положении на лотках в течение 1 — 2 сут. После этого их можно поместить вертикально в специальные коробки для гистологических препаратов.
Препараты, окрашенные на жир, заключают в глицерин, глицерин-желатину или в раствор ацетата калия. Для заключения препаратов, окрашенных на жир суданом, глицерин насыщают при нагревании хлоридом кадмия. Получающуюся после охлаждения сиропообразную жидкость используют в качестве среды для заключения. Для приготовления глицерин-желатины 7 г желатины оставляют набухать в 42 мл дистиллированной воды в течение нескольких часов, затем прибавляют 50 мл глицерина и 0,6 г кристаллов фенола, нагревают на водяной бане 10 — 15 мин при помешивании, фильтруют через стеклянную вату и остужают.
Для заключения небольшой кусочек застывшей массы кладут на покровное стекло, осторожно нагревают до расплавления, быстро переворачивают стекло и накладывают висячую каплю на препарат, где масса быстро растекается и застывает. Можно расплавить глицерин-желатину в водяной бане, стеклянной палочкой нанести на срез несколько капель и быстро накрыть покровным стеклом. Вместо глицерина используют насыщенный водный раствор ацетата калия.
Срезы, заключенные в глицерин или в ацетат калия, должны быть о к а н т о в а н ы, чтобы предотвратить испарение среды. Для этого кисточкой, смоченной в горячем парафине, проводят по краям покрытого стекла так, чтобы получился кант толщиной 3 — 4 мм. Можно производить окантовку канадским бальзамом по Целлеру. Для этого срез расправляют на маленьком (18х18 мм) покровном стекле и капают на него среду для заключения (например, глицерин). Быстро переворачивают покровное стекло так, чтобы срез со средой оказался внизу, и накладывают его на большее (24х 36 мм) покровное стекло так, чтобы большее стекло со всех сторон выступало за пределы малого. Заливочная среда не должна выступать изпод малого стекла, лишнюю среду нужно отсосать поставленной вертикально фильтровальной бумагой.
На чистое предметное стекло наносят 2 — 3 капли канадского бальзама и равномерно размазывают его на площади, несколько меньшей, чем площадь большего покровного стекла. Оба прилипших друг к другу покровных стекла кладут на слой бальзама меньшим стеклом вниз. В результате среда для заключения оказывается замкнутой под меньшим покровным стеклом и окружена широкой зоной бальзама. После высыхания бальзама полученный препарат очень удобно исследовать, в том числе под иммерсией.
219 Окрашивание срезов для обзорных целей Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т. д.). Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей. Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем — цитоплазма.
Ядерные (основные) красители. Для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематокснлина. Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха. Гематоксилин Эрлиха. Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96'/О спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности.
Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематокснлин успел окислиться в гематеин, который н является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином (см. ниже). Же лез н ы й г ем а то к силин Г ей де н г ай н аокрашивает в черный цвет не только ядра, но н митохондрии, темные диски скелетной н сердечной мышечной ткани и другие структуры. Для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 нед. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2 — 12 ч в 2,5'/о растворе железоаммначных квасцов.
Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кристаллы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1 — 36 ч раствором гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным.
В зависимости от исследуемого материала можно использовать н большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мнн при частой смене воды. Железный гематоксилин Вейгерта готовят в виде двух основных растворов — раствора Вейгсрта 1 и раствора Вейгерта П. Раствор Вейгерта 1 представляет собой 1% раствор 220 гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта 11 имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15 — 1,19) и 95 мл дисгиллированной воды.
Официнальный раствор полуторахлористого железа — это 50% раствор водного хлорного железа (ГеС1,, 6Н О). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3 — 4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1 — 5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором хлористоводородной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой.
Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя. Квасцовый кармин приготовляют, растворяя 3 — 5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания— 0,5 — 24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.
С а ф р а н и н является прекрасным ядерным красителем, особенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехгга» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 9б% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.
Кислые красители. Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для докрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
